郭帥 路曉光 戰(zhàn)麗彬 范治偉 宋軼 呂春雨 白黎智

失血性休克(hematogenic shock, HS)是臨床常見的危重癥[1-2]。HS時血液重新分布，腸道成為應(yīng)激反應(yīng)的中心，腸黏膜屏障功能破壞，腸源性細菌和內(nèi)毒素進人血液，是休克后發(fā)生膿毒血癥和MODS的重要原因之一。正常腸屏障功能的維系依靠機械、免疫、生物、化學4種屏障的共同作用，其中以機械屏障最為重要。上皮細胞緊密連接是構(gòu)成機械屏障的最主要結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)對維持腸屏障的正常功能具有重要作用，對腸黏膜機械屏障的保護是治療失血性休克的關(guān)鍵[3]。研究表明，ZO-1蛋白是腸道黏膜上皮細胞緊密連接的重要蛋白，被用來作為觀察各種組織緊密連接屏障功能和屏障通透性的指標已得到公認[4]，P-VASP通過介導(dǎo)ZO-1表達變化，從而調(diào)節(jié)細胞間緊密連接，調(diào)節(jié)屏障功能。近年來，中醫(yī)藥在HS并發(fā)癥防治上越來越具有優(yōu)勢[5-6]。本研究在既往研究的基礎(chǔ)上，探索大黃附子湯對HS大鼠腸黏膜屏障功能的保護作用。

材料與方法

一、一般資料

健康清潔級雄性SD大鼠，72只，5～7周齡，體重250～300 g，大連醫(yī)科大學動物實驗中心提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實驗前禁食12 h，禁水4 h。隨機分為：對照組、模型組、治療(大黃附子湯)組，每組24只，各組再按HS模型制備成功后0、6、12 h分為三個亞組，每組8只大鼠。模型組、治療組采用Wiggers改良法制備HS大鼠模型，模型組以9%等滲鹽水保留灌腸，治療組予以大黃附子湯保留灌腸治療。

試劑和儀器：大黃附子湯：附子9 g(先煎)，大黃9 g(后下)，細辛3 g常規(guī)水煎制成懸濁液，劑量為200 mL(大連大學附屬中山醫(yī)院藥劑科)，置100℃水浴消毒80 min，冷卻后置4℃冰箱備用。大鼠腸脂肪酸結(jié)合蛋白(iFABP)ELISA試劑盒(美國CUSABIO公司)。EKT-5Mset動態(tài)革蘭氏陰性菌檢測試劑盒(一瑞生物工程有限公司)。兔抗大鼠p-VASP蛋白抗體(Serl57)(美國Cell signal公司)。兔抗大鼠ZO-1抗體(美國santa Cruz生物公司)。16道生理信號分析記錄系統(tǒng)MPl50(美國BIOPAC公司)。

二、方法

1.動物模型制作：采用Wiggers改良法制備HS大鼠模型[7-9]。(1)腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉(按40 mg/kg)麻醉。(2)行右頸總動脈插管，外接16道生理信號分析記錄系統(tǒng)監(jiān)測平均動脈壓(MAP)。(3)左股動脈留置導(dǎo)管，按800 U/kg全身肝素化后左股動脈導(dǎo)管放血，HS 0 h組、6 h組、12 h組大鼠經(jīng)放血1.5～2 mL后血壓降至35～45 mmHg，停止后血壓逐漸上升，再次緩慢放血后血壓降至35～45 mm Hg并穩(wěn)定60 min。(4)復(fù)蘇：經(jīng)右股靜脈回輸全部放出的血液及2倍量的林格氏液，復(fù)蘇標準為平均動脈壓穩(wěn)定在90 mmHg(1 mmHg=0.133KPa)。對照組大鼠僅進行手術(shù)插管及肝素化處理。各組大鼠于各時相點進行標本取材。

2.治療方案：對照組依次行腹腔麻醉，右頸總動脈、右股靜脈、左股動脈插管及全身肝素化后即刻、3、8 h分別予以0.9%等滲鹽水2 mL保留灌腸。模型組和大黃附子湯組分別在復(fù)蘇后即刻、3 h、8 h分別予以0.9%等滲鹽水、大黃附子湯2 mL保留灌腸。

3.指標檢測：分別于0、6、12 h經(jīng)右股靜脈采血，4℃以3 000 r/min速度全血離心，30 min分裝血清，ELISA法檢測靜脈血清中IFABP濃度的變化，動態(tài)比濁法檢測血清中LPS濃度的變化。光鏡觀察大鼠回腸黏膜病理改變，采用Chiu等[10]的方法計算小腸上皮細胞損傷指數(shù)(表1)。 Western blot與免疫組化法測定ZO-1、p-VASP蛋白表達。

表1 小腸上皮損傷指數(shù)分級標準

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、血清中LPS含量變化

與對照組比較，模型組在復(fù)蘇后即刻，大鼠血清中LPS含量明顯升高，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，大黃附子湯組大鼠血清中LPS含量在6 h降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在12 h時明顯降低，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)見表2。

表2 對照組、模型組、大黃附子湯組大鼠血清LPS含量變化

注：與對照組比較：aP<0.01；與模型組比較：cP<0.05，dP<0.01。LPS為內(nèi)毒素；HS為失血性休克。

二、血清中IFABP含量的變化

與對照組比較，模型組在休克1 h時，大鼠血清中IFABP含量明顯升高，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(aP<0.01)；與模型組比較，大黃附子湯組大鼠血清中IFABP含量在6 h降低，差異具有統(tǒng)計學意義(cP<0.05)，在12 h時明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(dP<0.01)。見表3。

表3 對照組、模型組、大黃附子湯組大鼠血清IFABP含量變化

注：與對照組比較：aP<0.01；與模型組比較：cP<0.05，dP<0.01。IFABP為脂肪酸結(jié)合蛋白；HS為失血性休克。

三、光鏡下小腸黏膜改變。

光鏡下復(fù)蘇后大鼠小腸黏膜層絨毛水腫嚴重，黏膜固有層腺體呈灶性區(qū)域性壞死；大黃附子湯組6、12 h小腸粘膜變化明顯減輕，且小腸黏膜絨毛水腫、壞死及倒伏程度均好于模型組(見圖1)。與對照組比較，模型組在休克復(fù)蘇后，小腸上皮損傷指數(shù)明顯升高，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較，大黃附子湯組大鼠小腸上皮損傷指數(shù)在6 h降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，在12 h時明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表4。

注：a.對照組0 h;b.對照組6 h;c.對照組12 h;d.模型組0 h;e.模型組6 h;f.模型組12 h;g.大黃附子湯組0 h;h.大黃附子湯組6 h;i.大黃附子湯組12 h

圖1對照組、模型組和大黃附子湯組小腸HE染色組織病理學表現(xiàn)(HE×400)

表4 對照組、模型組、大黃附子湯組大鼠小腸組織學評分

注：與對照組比較：aP<0.01；與模型組比較：cP<0.05，dP<0.01。HS為失血性休克。

四、小腸黏膜ZO-1、P-VASP蛋白含量變化

免疫印跡結(jié)果顯示模型組、大黃附子湯組各時間點小腸黏膜ZO-1蛋白含量、免疫組化評分均較對照組低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較大黃附子湯組小腸黏膜ZO-1蛋白含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；P-VASP蛋白含量、免疫組化評分均較對照組高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與模型組比較大黃附子湯組小腸黏膜P-VASP蛋白含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。(見表5，圖2～4)。

表5 對照組、模型組、大黃附子湯組大鼠小腸ZO-1、P-VASP蛋白表達情況

注：與對照組比較：aP<0.01；與模型組比較：cP<0.05，dP<0.01

圖2各組大鼠小腸ZO-1、P-VASP蛋白表達情況。A/E=β-actin；B/F= ZO-1/P-VASP對照組6 h、12 h；C/G=ZO-1/P-VASP模型組6 h、12 h；D/H=ZO-1/ P-VASP治療組6 h、12 h。

治療組與模型組比較，隨時間推移血流增加，血清內(nèi)毒素、脂肪酸結(jié)合蛋白(IFABP)含量逐漸減低，腸道黏膜損傷程度逐漸減輕，p-VASP蛋白表達下調(diào)，ZO-1表達上調(diào)。

討 論

失血性休克時由于體內(nèi)血流重新分布，腸道最先受累且缺血最重。黏膜屏障功能的破壞，腸道菌群移位是導(dǎo)致疾病惡化的根本原因[11]，其誘發(fā)、加重全身炎性反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征，后者釋放各種炎性介質(zhì)和細胞因子，再次加重腸損傷，形成惡性循環(huán)[12-13]。

本研究監(jiān)測HS大鼠復(fù)蘇后腸道血流量，提示HS復(fù)蘇后各時間點大鼠回腸末端血流量較對照組明顯減少，復(fù)蘇后腸道缺血持續(xù)存在(另文報告)，體內(nèi)LPS水平、血清IFABP含量明顯增高。與Vega等[14]的研究結(jié)果一致，提示腸道缺血引發(fā)了腸黏膜的透過性增加，腸道長時間缺血導(dǎo)致小腸黏膜屏障功能遭到破壞，大量細菌及內(nèi)毒素釋放入血。

腸黏膜上皮細胞的緊密連接是維持腸黏膜機械屏障功能最重要的因素[15-17],是細胞間最重要的連接方式，也是維持腸黏膜機械屏障功能最重要的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。本研究表明，大鼠HS復(fù)蘇后，細胞的緊密連接即發(fā)生變化，與上皮細胞間緊密連接形成的最重要的結(jié)構(gòu)蛋白ZO-1表達下調(diào)，并與血漿細菌內(nèi)毒素、血清IFABP及腸道黏膜損傷程度變化趨勢具有一致性。

大黃附子湯源自張仲景《金匱要略》，由大黃、附子、細辛組成，含大黃素、烏頭堿和細辛醚等有效成分。方中三藥合用，寒熱并重，既溫腎暖脾，助陽以扶正，又通腑泄熱，活血散結(jié)以祛邪，有效改善胃腸功能，減少腸內(nèi)有害物質(zhì)的吸收和進入體內(nèi)的細菌數(shù)量，降低腸源性內(nèi)毒素移位的發(fā)生率[18-19]。

注：a.對照組0 h;b.對照組6 h;c.對照組12 h;d.模型組0 h;e.模型組6 h;f.模型組12 h;g.大黃附子湯組0 h;h.大黃附子湯組6 h;i.大黃附子湯組12 h

圖3對照組、模型組和大黃附子湯組ZO-1免疫組化表達(HE×200)

注：a.對照組0 h;b.對照組6 h;c.對照組12 h;d.模型組0 h;e.模型組6 h;f.模型組12 h;g.大黃附子湯組0 h;h.大黃附子湯組6 h;i.大黃附子湯組12 h

圖4對照組、模型組和大黃附子湯組P-VASP免疫組化表達(HE×200)

本研究結(jié)果顯示，HS大鼠復(fù)蘇后輔以大黃附子湯, 能夠顯著降低血清濃度IFABP和內(nèi)毒素水平。表明大黃附子湯通過調(diào)節(jié)ZO-1、p-VASP蛋白，減輕了失血性休克復(fù)蘇后腸道黏膜屏障損傷。

1 趙曉東．戰(zhàn)(創(chuàng))傷失血性休克的液體復(fù)蘇策略及存在的問題[J]．中華急診醫(yī)學醫(yī)學雜志，2013，22(10)：1080-1083.

2 Vanzant EL1，Hilton RE2，Lopez CM，et al.Advanced age is associated with worsened outcomes and a unique genomic response in severely injured patients with hemorrhagic shock[J].Crit Care，2015，19：77．

3 Angele MK，Schneider CP，Chaudry IH．Bench-to-bedside review: latest results in hemorrhagic shock[J]．Crit Care，2008，12(4)：218．

4 王慶剛，雷若慶，許志偉，等．急性出血壞死性胰腺炎大鼠腸道黏膜屏障功能變化及己酮可可堿對其的保護作用[J]．中華胰腺病雜志，2011，11(2)：117-120．

5 康新，梁正凱，路曉光，等．大黃附子湯對重癥急性胰腺炎腸黏膜上皮細胞線粒體超微結(jié)構(gòu)和離子泵的影響[J]．中華實驗外科雜志，2015，23(1)：41-44．

6 王小周，路小光，康新，等．丙酮酸鈉液腹腔復(fù)蘇對失血性休克大鼠腸黏膜屏障的保護作用[J]．中華急診醫(yī)學雜志，2014，23(10)：1120-1124．

7 褚萬立，劉軍英，劉雪峰，等．失血性休克大鼠模型的改進及胃黏膜血流量的測定[J]．中國實驗動物學報，2008，16(1)：6-9．

8 Shi HP，Deitch EA，Da Xu Z，et al．Hypertonic saline improves intestinal mucosa barrier function and lung injury after trama-hemorrhagic shock[J]．Shock，2002，17(6)：496-501．

9 Hammerman C，Goldschmidt D，Caplan MS，et al．Amelioration of ischemreperfusion injury in rat intestine by pentoxifyline-mediated inhibit of xanthine oxidase[J]．J Pediatr Gastrol Nutr，1999，29(1)：69-74．

10 Chiu CJ，McArdle AH，Brown R，et al.Intestinal mucosal lesion in low-flow states. I. A morphological, hemodynamic, and metabolic reappraisal[J].Arch Surg，1970，101(4)：478-483.

11 Sonnier Dl，Makley AT，F(xiàn)riend LA，et al．Hemorrhagic shock induces a proinflammatory milieu in the gut lumen[J]．J Surg Res，2011，170(2)：272-279.

12 Tiall R，Tan JT，Wang RL，et al．The role of intestinal mucosa oxidativestress in gut barrier dysfunction of severe acute pancreatitis [J]．Eur Rev Med Pharmacol Sci，2013，17(3)：349-355．

13 劉莉，路小光，范治偉，等. 失血性休克對大鼠腸黏膜屏障Occludin表達的影響[J]. 中華創(chuàng)傷雜志，2013，29(12)：1230-1235.

14 Vega D，Badami CD，Caputo FJ，et al．The influence of the typeof resuscitation fluid on gut injury and distant organ injury in a ratmodel of trauma/hemorrhagic shock[J]．J Trauma，2008，65(2)：409-415．

15 Wang N，Yu H，Ma J，et al．Evidence for tight junction proteindisruption in intestinal mucosa of malignant obstructive jaundicepatients[J]．Seand J Gastroenterel，2010，45(2)：191-199．

16 Smyth SH，Doyle-McCullough M，Cox OT，et al．Effect of re．productive status on uptake of latex mieroparticles in rat small intestine[J]．Life Sci，2005，77(26)：3287-3305．

17 Walsh-Reitz MM，Huang EF，Musch MW，et al．AMP-18protects barrier function of colonic epithelial cells：role of tightjunction proteins[J]．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2005，289(1)：163-171．

18 路小光，戰(zhàn)麗彬，康新，等．大黃附子湯對急性壞死性胰腺炎大鼠小腸黏膜屏障功能的保護作用[J]．中華胰腺病雜志，2011，11(2)：113-116．

19 路小光，戰(zhàn)麗彬，康新，等．重癥急性胰腺炎并發(fā)肺損傷促/抗炎癥因子的變化及大黃附子湯的干預(yù)研究[J/CD]．中華臨床醫(yī)師雜志(電子版)，2010，4(11)：22-26．