李龍昱(1978～)，男，漢族，甘肅籍，主管藥師

唐古特大黃多糖對RAW264.7巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)作用的影響

李龍昱

(青海省人民醫(yī)院藥學部)

摘要目的研究唐古特大黃多糖對RAW264.7巨噬細胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。方法以小鼠腹腔巨噬細胞系RAW264.7為研究對象，分不同濃度的唐古特大黃多糖實驗組、脂多糖陽性對照組、不加任何樣品的空白對照組。通過MTT實驗、吞噬中性紅實驗、一氧化氮釋放量及細胞因子(IL-1β、IL-6、IFN-α、IFN-γ)的分泌水平，研究唐古特大黃多糖的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果實驗表明唐古特大黃多糖在一定濃度范圍可以促進吞噬細胞的增殖，并可增強其吞噬作用；唐古特大黃多糖可以有效提高巨噬細胞產(chǎn)生NO的量，且對巨噬細胞的細胞因子IL-1β、IL-6、IFN-α、IFN-γ的分泌量均有一定程度的提高。結(jié)論唐古特大黃多糖具有較好的提高巨噬細胞免疫功能的作用。

關鍵詞唐古特大黃巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)

中圖分類號R967

文獻標識碼A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.010

AbstractObjectiveTo investigate the influence of rheum tanguticum polysaccharides on the immunomodulatory effectsofRAW264.7macrophage.Methods To take murineintraperitonealRAW264.7macrophage as the research objects and different concentrations of rheum tanguticum polysaccharides and LPS injected into mice as positive control，without any treating asthe blank control.The influence of rheum tanguticum polysaccharides on the immunomodulatory effectsofRAW264.7macrophage was detected by MTT，phagocytosis test，NO release and the secretion of cytokines such as IL-1β，IL-6，IFN-α and IFN-γ.Results Experiments showed that rheum tanguticum polysaccharides can accelerate the proliferation of phagocytic cells to have a good phagocytosis.Besides，it can improve the macrophage to generate NO，and had a good promotion in enhancing the secretion of cytokines such as IL-1β，IL-6，IFN-α and IFN-γ.Conclusion Rheum tanguticum polysaccharides can obviously enhance the function of macrophage.

KeywordsRheum tanguticumMacrophagesImmunomodulatory effect

收稿日期2015-04-12

THE INFLUENCE OF RHEUM TANGUTICUM

POLYSACCHARIDES ON THE IMMUNOMODULATORY

EFFECTS OF RAW264.7MACROPHAGE

Li Longyu

(The Pharmaceutical Department of the People's Hospital of Qinghai Province)

唐古特大黃(R.tanguticumMaxim.exBalf.)是大黃藥材的重要基原，《中國藥典》收錄的3種大黃基原中以唐古特大黃質(zhì)量最優(yōu)[1]。唐古特大黃為青海省的道地藥材，臨床主要用于治療腎衰竭、重癥急性胰腺炎、萎縮性胃炎等[2]。中藥多糖在免疫調(diào)節(jié)方面展示出較好的潛力，受到越來越多的關注[3，4]。有文獻報道大黃多糖具有免疫調(diào)節(jié)的作用[5]。故本研究以小鼠腹腔巨噬細胞系RAW264.7為研究對象，檢測唐古特大黃多糖對巨噬細胞的體外免疫調(diào)控作用，為唐古特大黃多糖的綜合開發(fā)和利用提供一定的參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1　材料

1.1.1材料與試劑

唐古特大黃(青海省藥材公司)；小鼠單核巨噬RAW264.7細胞株(江蘇省藥物研究所)；PBS(博士微生物工程有限公司)；胰蛋白酶(Bio-sharp公司)；DMEM培養(yǎng)液(Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；青霉素-鏈霉素雙抗(Hyclone公司)；MTT(solarbio)；脂多糖(LPS，Solarbio公司)。其他試劑均為分析純。NO試劑盒、ELISA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.2儀器與設備

超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)；電子分析天平(AY220，日本島津，精度為萬分之一)；全自動酶標儀(Molecular Devices Spectra max PLUS 384，BIO-RAD)；超低溫冰箱(MDF-382ECM，日本SANYO)；微型漩渦混懸器(WH-90A，上海振榮科學儀器有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；恒溫水浴箱(常州國華電器有限公司)；超聲波清洗器(KQ-500B，嘉禾儀器有限公司)。細胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)；微量加樣器(Eppendorf)；96孔板(Corning公司)。

1.2　實驗方法

1.2.1唐古特大黃多糖的制備

取唐古特大黃適量，加20倍體積的水煎煮1 h后紗布過濾，藥渣再加入10倍量的水煎煮1 h，合并兩次煎煮的藥液。取適量的水煎液，緩慢加入95%乙醇使乙醇終濃度達到70%，放入4 ℃冰箱靜置過夜后，離心(3000r/min)10 min后抽濾，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌脫色，得唐古特大黃粗多糖備用。

1.2.2RAW264.7細胞增殖實驗

取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞吹打均勻后按105個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加入細胞200 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，顯微鏡下觀察，待細胞貼壁后，棄去上清液，分別加入用不含血清的DMEM的培養(yǎng)液配成的終濃度為10、25、50、100、200 μg/mL唐古特大黃多糖溶液200 μL，空白對照組為不含血清的DMEM培養(yǎng)液，陽性對照組用10 μg/mL LPS，每組設6個復孔。在相同的培養(yǎng)條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)上清液，每孔加入濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液(PBS配制)，每孔200 μL，放入孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入DMSO 150 μL，搖床上震蕩5 min ，設定波長為490 nm，測定吸光度值。細胞的增殖能力用增殖指數(shù)表示，計算公式如下：

細胞增殖指數(shù)=樣品的吸光度值/空白對照的吸光度值

1.2.3RAW264.7細胞吞噬中性紅實驗

參照文獻方法測定[6]。細胞對中性紅吞噬能力用吞噬指數(shù)表示。計算公式如下：

吞噬指數(shù)=樣品的OD值/空白對照的OD值

1.2.4細胞因子的測定

將培養(yǎng)好的細胞，分別加入不同濃度的唐古特大黃多糖溶液，設空白對照組和陽性對照組(10μg/mL的LPS)，每組3個復孔。收集各組的上清液，按ELISA 試劑盒說明書測定各細胞因子(NO、IL-1β、IL-6、IFN-α、IFN-γ)的含量。

1.2.5數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差(One-way ANOVA)分析，P值小于0.05表明組間有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1　唐古特大黃多糖對RAW264.7細胞增殖的影響

如圖1所示，濃度為(10～200)μg/mL的唐古特大黃多糖對RAW264.7細胞的增殖指數(shù)相對于空白對照組有顯著性差異(P<0.05)，其對巨噬細胞增殖指數(shù)隨著樣品濃度的增加而增大，表現(xiàn)出一定的量效關系。表明唐古特大黃多糖在一定濃度范圍具有較好的促進RAW264.7細胞的增殖的作用。

2.2　唐古特大黃多糖對RAW264.7細胞吞噬作用的影響

腹腔巨噬細胞具有一定的吞噬能力，可以有效地吞噬外來的微生物或病毒，有效地保證機體免受外來病菌的入侵，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而維持人體的健康。如圖2所示，與空白對照相比，陽性藥組能極顯著(P< 0.001)地提高巨噬細胞吞噬中性紅細胞的能力，吞噬指數(shù)的值為1.69；當濃度為10、25、50、100、200 μg/mL的唐古特大黃多糖溶液作用24 h后，巨噬細胞的吞噬指數(shù)與空白對照相比，均具有極顯著性差異(P<0.05)。在(10～200)μg/mL濃度范圍內(nèi)，吞噬指數(shù)隨濃度升高顯著提高，表明唐古特大黃多糖具有提高巨噬細胞的吞噬作用的功能，可以有效地提高機體的免疫調(diào)節(jié)能力而達到抵御病菌的目的。

Figure 1　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on the index of RAW264.7 cells proliferation(24h)

Figure 2　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on RAW264.7 cells phagocytosis

2.3　唐古特大黃多糖對RAW264.7細胞釋放NO的影響

NO是新發(fā)現(xiàn)的一種重要的信使分子，具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用[7]。如圖3所示，不同濃度的唐古特大黃多糖對RAW264.7細胞釋放NO產(chǎn)生影響。當巨噬細胞未進行藥物處理時NO釋放量比較低，這可能與iNOS蛋白的表達有一定的關系。經(jīng)過LPS刺激后，NO的含量顯著增加(P<0.001)，含量達到65.27 μmol/L。與空白對照相比，當唐古特大黃多糖濃度為10 μg/mL時，無顯著性提高。而當藥物濃度為(25～200)μg/mL時可以明顯提高NO的釋放量。

Figure 3　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on NO production of RAW264.7 cells

2.4　唐古特大黃多糖對RAW264.7細胞分泌細胞因子的影響

白介素-1(IL-1)又稱淋巴細胞刺激因子，分為IL-1α和IL-1β兩種，其中IL-1β是內(nèi)皮細胞活化因子，是一種主要起免疫調(diào)節(jié)作用的激素樣肽類物質(zhì)。如圖4所示，不同濃度的唐古特大黃多糖對巨噬細胞分泌IL-1β均有一定的提高。與空白組相比，當多糖濃度為(10～25)μg/mL時，IL-1β的含量無顯著提高，而在濃度范圍為(50～200)μg/mL時，具有顯著性差異(P<0.05)。

Figure 4　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on the IL-1β secretion of RAW264.7 cells

IL-6可由多種細胞如巨噬細胞、成纖維細胞、T細胞、B細胞等細胞產(chǎn)生。它可調(diào)節(jié)多種細胞的生長與分化，誘導B細胞的增殖分化，促進其分泌抗體，具有調(diào)節(jié)免疫應答、急性期反應及造血功能，并在機體的抗感染免疫反應中起重要作用。如圖5所示，當唐古特大黃多糖濃度較低(10μg/mL)時，IL-6分泌量沒有顯著性的增加。當唐古特大黃多糖濃度為(25～200)μg/mL時有顯著提高巨噬細胞分泌IL-6分泌的能力，200μg/mL的多糖組的IL-6分泌量達到141.12 pg/mL。

Figure 5　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on the IL-6 secretion of RAW264.7 cells

Figure 6　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on the IFN-αsecretion of RAW264.7 cells

Ⅰ型干擾素主要包括IFN-α、IFN-β，IFN-α主要由單核-巨噬細胞產(chǎn)生。如圖6所示，當唐古特大黃多糖濃度為200 μg/mL時，巨噬細胞RAW264.7產(chǎn)生的IFN-α的量達到94.65 pg/mL，在濃度(25～200)μg/mL之間IFN-α產(chǎn)生的量呈現(xiàn)顯著性差異。表明唐古特大黃多糖具有較好的刺激巨噬細胞分泌IFN-α作用。

N-γ也可使巨噬細胞表面MHCⅡ類分子的表達量增加，增強其抗原遞呈的能力。此外還可以通過增強巨噬細胞表面表達Fc受體，促進巨噬細胞吞噬免疫復合物、抗體包被的病原體和腫瘤細胞。如圖7所示，經(jīng)LPS刺激后RAW264.7細胞分泌IFN-γ的含量相對于正常組顯著增加(P<0.001)。唐古特大黃多糖各濃度組均有促進IFN-γ分泌的功能，在濃度范圍為(25～200)μg/mL時有顯著性差異(P<0.05)。表明唐古特大黃多糖具有較好的促進巨噬細胞分泌IFN-γ的功能。

Figure 7　Effects of Rheum tanguticumpolysaccharide on the IFN-γsecretion of RAW264.7 cells

3討論

研究表明巨噬細胞是免疫系統(tǒng)中一種重要的吞噬細胞[6]。唐古特大黃多糖在一定的濃度范圍內(nèi)可以促進巨噬細胞的增殖。從巨噬細胞吞噬中性紅細胞的實驗可以看出，唐古特大黃多糖具有較好的吞噬作用，在(10～200)μg/mL濃度范圍內(nèi)，吞噬指數(shù)由1.16增加到1.78，表現(xiàn)出較好的量效關系。巨噬細胞發(fā)揮抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥效可以由NO的釋放多少進行調(diào)節(jié)。通過唐古特大黃多糖作用于RAW264.7細胞，結(jié)果表明唐古特大黃多糖可以有效提高巨噬細胞產(chǎn)生NO的量，這可能與其能誘導RAW264.7 細胞中iNOS的表達有關。實驗發(fā)現(xiàn)唐古特大黃多糖對NO產(chǎn)生明顯的增加作用，而沒有直接的細胞毒性作用，為隨后有關對細胞因子產(chǎn)生的影響作用的研究提供一定的劑量參考。唐古特大黃多糖對巨噬細胞的細胞因子IL-1β、IL-6、IFN-α、IFN-γ分泌量的提高均有一定程度的影響，表明唐古特大黃多糖具有較好的提高巨噬細胞免疫功能的作用?，F(xiàn)代研究表明，中藥中的多糖在免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)方面起到重要的作用。但作為大分子化合物，其生物利用度比較低，多糖是如何發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機制尚不明確，值得深入研究。本研究以傳統(tǒng)中藥大黃為研究對象，細胞實驗已經(jīng)初步證實大黃多糖具有較好的免疫調(diào)節(jié)的作用，為后續(xù)的整體動物免疫調(diào)節(jié)的研究提供了一定的參考依據(jù)。

參考文獻

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