※：青海省科技創(chuàng)新能力促進(jìn)計(jì)劃項(xiàng)目(2015-ZJ-943Q)，青海省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012-Z-722)，青海大學(xué)附屬醫(yī)院中青年科研基金項(xiàng)目(ASRF-2014-18)

陳曉娟(1979～)，女，回族，青海籍， 醫(yī)學(xué)碩士，主治醫(yī)師

BDNF對(duì)大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響

陳曉娟1，肖宗宇2，潘琪3，惠超杰2，侯倩1，才鼎1

(1.青海省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科；3.海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科)

摘要目的觀察腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF)對(duì)體外培養(yǎng)的Wistar大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響。方法運(yùn)用無血清培養(yǎng)基成功培養(yǎng)Wistar大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞，并對(duì)分離獲得的懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)細(xì)胞球，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD133和Nestin表達(dá)情況。采用10%胎牛血清誘導(dǎo)其分化，并添加10 ng/mL BDNF，分化7 d后，采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色方法檢測(cè)分化后GFAP、Map2、β-tubulin III、Galc的表達(dá)情況。結(jié)果大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中，呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)，形成細(xì)胞球，經(jīng)免疫熒光檢測(cè)，細(xì)胞球表達(dá)CD133和Nestin。將細(xì)胞球轉(zhuǎn)入含血清培養(yǎng)基分化7 d后，表達(dá)GFAP的陽性細(xì)胞占61.78%±3.54%，Map2陽性細(xì)胞占6.28%±0.80%，β-tubulin III陽性細(xì)胞占7.43%±1.09%，Galc陽性細(xì)胞占2.79%±0.62%。添加10 ng/mL BDNF后，表達(dá)GFAP的陽性細(xì)胞占62.76%±2.94%，Map2陽性細(xì)胞占14.29%±2.45%，β-tubulin III陽性細(xì)胞占13.13%±2.42%，Galc陽性細(xì)胞占2.97%±0.82%。分別經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢測(cè)，BDNF組分化為Map2及β-tubulin III陽性細(xì)胞，顯著高于血清組(P<0.05)，但BDNF組分化為GFAP及Galc陽性細(xì)胞與血清組相比，無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論BDNF可顯著提高Wistar大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的比例。

關(guān)鍵詞骨髓基質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞BDNF 分化

中圖分類號(hào)R332

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

DOI：10.13452/j.cnki.jqmc.2015.03.006

AbstractObjectiveTo investigate the inducing effects of BDNF on the differentiation of expression marker of bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells.Methods Wistar rats bone marrow mesenchymal stem cells were cultured in serum-free medium，which was composed of DMEM/F12，20 ng/mL bFGF and 20 ng/mL EGF.Floating neural spheres could be seen in serum-free medium.Expressions of CD133 and Nestin of Neural spheres were detected by immunocytochemistry.Then these neural spheres were randomly divided into two groups，group A were transferred into serum-containing medium(DMEM/F12+10%FBS)，group B were cultured in DMEM/F12 medium with 10%FBS and 10ng/mL BDNF. 7 days later，expressions of GFAP、Map2、β-tubulin III、Galc were detected by immunocytochemistry.Results Neural spheres were formed after Wistar rats bone marrow mesenchymal stem cells were cultured in serum-free medium，immunocytochemistry demonstrated these neural sphere cells were positive for CD133 and Nestin. When these neural sphere cells were cultured in DMEM/F12 medium with 10%FBS for 7 days，immunocytochemistry found that these differentiated cells were positive for GFAP，Map2，β-tubulin III and Galc，and the positive rate were as followed，GFAP 61.78%±3.54%，Map2 6.28%±0.80%，β-tubulin III 7.43%±1.09%，Galc 2.79%±0.62%.When 10 ng/mL BDNF was added in the serum-containing medium，the positive rate of these were as followed，GFAP 62.76%±2.94%，Map2 14.29%±2.45%，β-tubulin III 13.13%±2.42%，Galc 2.97%±0.82%.The positive rate of Map2 and β-tubulin III was much higher in the group(serum-containing medium with BDNF)(P<0.05).There was no significant difference in the positive rate of GFAP and Galc between the two groups(P>0.05).Conclusion BDNF could significance increase the rate of neurons when neural stem cells derived from bone marrow of wistar rats were cultured in differentiation condition.

KeywordsBone marrow mesenchymal stem cellsNeural stem cells Bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cellsBDNFdifferentiation

收稿日期2015-06-03

THE EFFECTS OF BDNF ON THE DIFFERENTIATION

OF BONE MARROW MESENCHYMAL STEM CELLS-DERIVED

NEURAL STEM CELLS

Chen xiaojuan1，Xiao zongyu2，Pan qi3，Hui chaojie2，Hou qian1，Cai ding1

(1.Department of Neurology，People’s Hospital of Qinghai Province，Xining 810000，China；

2.Department of neurosurgery，Affiliated hospital of Qinghai University，Xining 810000，China；

3.Department of neurosurgery，Affiliated hospital of Hainan University，Haikou 570100， China)

腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)可否促進(jìn)大鼠BMSCs-NSCs向神經(jīng)元方向分化？

骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)已成為較理想的種子細(xì)胞來源之一[1]。近年來，隨著神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)研究的不斷深入，部分研究者將BMSCs成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出了骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem cells，BMSCs-NSCs)[2，3]。BDNF是一種具有防止神經(jīng)元死亡功能的蛋白質(zhì)，它在體外可保持NSCs的活性和促進(jìn)其向神經(jīng)元分化[4，5]。為探討B(tài)DNF對(duì)BMSCs-NSCs生長(zhǎng)分化的影響，本研究擬通過設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)方案，給出相關(guān)答案。

1材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

SPF級(jí)8周齡Wistar雄性大鼠12只，平均體重200～220 g，由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[合格證號(hào)：SCXK(甘)2013-0002]。

1.2　試劑選擇

DMEM/F12培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶為Gibco公司產(chǎn)品。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)為Hyclone公司產(chǎn)品。B27添加劑購(gòu)自Invitrogen公司。表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(BDNF)為Peprotech公司產(chǎn)品，小鼠抗Nestin抗體、兔抗GFAP抗體、小鼠抗Galc抗體為Chemicon公司產(chǎn)品，兔抗CD133抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，小鼠抗Map2抗體、兔抗β-tubulin III抗體為Abcam公司產(chǎn)品。Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG、Alexa Fluor 594標(biāo)記羊抗兔IgG和Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG由Molecular Probes公司生產(chǎn)。DAPI封片劑為Vector Laboratories公司產(chǎn)品。

1.3　骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)

無菌條件下取大鼠雙側(cè)股骨和肱骨，用10 mL DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集骨髓組織懸液，以含10%FBS的DMEM/F12重懸，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。收集第四代BMSCs，經(jīng)0.25%胰酶消化，制備單細(xì)胞懸液，以含20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF及1：50的B27添加劑的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基重懸，接種密度設(shè)為2×105個(gè)活細(xì)胞/mL，隔天換半液一次并添加相應(yīng)劑量生長(zhǎng)因子。

1.4　大鼠骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞CD133和Nestin檢測(cè)

選取在無血清培養(yǎng)基中呈懸浮生長(zhǎng)的狀態(tài)良好的大鼠骨髓源神經(jīng)細(xì)胞球，去除培養(yǎng)基，采用4%多聚甲醛固定30 min，0.3%Triton X-100破膜10 min，10%山羊血清37 ℃封閉60 min，不沖洗；滴加一抗CD133(1：200)和Nestin(1：100)，置濕盒、4 ℃過夜；滴加二抗：Alexa Fluor 594標(biāo)記羊抗兔IgG(1：200)和Alexa Fluor 488標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1：200)，37 ℃孵育1 h；然后使用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染并封片。以上各步驟前后均使用0.01 mol/L PBS沖洗(3次×5min)。

1.5　大鼠骨髓源性神經(jīng)干細(xì)胞的分化

收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的大鼠骨髓源性神經(jīng)球，或?qū)⑸窠?jīng)球消化制備為單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)活細(xì)胞/mL，重懸于新的培養(yǎng)瓶。實(shí)驗(yàn)分兩組，血清組：將細(xì)胞接種于含血清培養(yǎng)基(DMEM/F12+10% FBS)；BDNF組：在血清組的基礎(chǔ)上，加入10 ng/mL BDNF，分化7 d后，采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法對(duì)GFAP、Map2、β-tubulin III、Galc的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，并使用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。在熒光顯微鏡下，隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野并拍照，分別計(jì)算每個(gè)視野呈GFAP、Map2、β-tubulin III、Galc陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算每個(gè)視野呈DAPI藍(lán)染的細(xì)胞核總數(shù)，按下列公式分別計(jì)算各標(biāo)志物陽性細(xì)胞百分率：陽性細(xì)胞百分率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，視P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1　大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中呈貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)以長(zhǎng)梭形為主，體積較小、大小基本一致，增殖速度較快。將第四代大鼠BMSCs轉(zhuǎn)入含20 ng/mLbFGF、20 ng/mLEGF及B27添加劑(150)的DMEM/F12培養(yǎng)基后，其增殖方式發(fā)生改變，細(xì)胞呈懸浮球狀聚集生長(zhǎng)，球體呈圓形或橢圓形，球體內(nèi)細(xì)胞呈圓形，有較強(qiáng)的折光性，增殖速度較慢。經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測(cè)，所形成的細(xì)胞球表達(dá)CD133和Nesitn(圖1)。

大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞Nestin(綠色、圖A)、CD133(紅色、圖B)呈陽性，細(xì)胞核以DAPI復(fù)染(藍(lán)色、圖C)，熒光顯微鏡標(biāo)尺為50 μm

Expressions of Nestin(A)and CD133(B)of bone marrow mesenchymal stem cells-derived neural stem were detected by immunocytochemistry.The nuclei were counterstained with DAPI(blue)， Scale bar=50 μm

圖1大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞Nestin和CD133的免疫熒光檢測(cè)圖

Figure 1Expressions of Nestin and CD133 of BMSC-NSCs by immunocytochemistry

2.2　大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞的分化及鑒定

將大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞從含bFGF、EGF等生長(zhǎng)因子的無血清培養(yǎng)基中移出，并轉(zhuǎn)入含10%FBS的DMEM/F12含血清培養(yǎng)基后，細(xì)胞球或單細(xì)胞均呈貼壁生長(zhǎng)，長(zhǎng)出突起，形似神經(jīng)元樣或膠質(zhì)細(xì)胞樣。分化7 d后，行免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)，血清組表達(dá)GFAP的陽性細(xì)胞占61.78%±3.54%，Map2陽性細(xì)胞占6.28%±0.80%，β-tubulin III陽性細(xì)胞占7.43%±1.09%，Galc陽性細(xì)胞占2.79%±0.62%。BDNF組表達(dá)GFAP、Map2、β-tubulin III和Galc的陽性細(xì)胞比率分別為62.76%±2.94%、14.29%±2.45%、13.13%±2.42%和2.97%±0.82%。分別經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，BDNF組分化為Map2及β-tubulin III陽性細(xì)胞顯著高于單純血清組(P<0.05)，但BDNF組分化為GFAP及Galc陽性細(xì)胞與單純血清組相比，無顯著性差異(P>0.05)(圖2、表1)。

將大鼠骨髓源神經(jīng)球轉(zhuǎn)入含血清培養(yǎng)基后，大部分細(xì)胞呈GFAP陽性，少部分細(xì)胞呈Map2、Galc和β-tubulin III陽性。細(xì)胞核以DAPI復(fù)染(藍(lán)色).熒光顯微鏡，放大倍數(shù)：×200

After BMSC-NSCs were cultured in serum-containing medium for 7 days，these cells derived from BMSCs-NSCs were positive for GFAP，MAP2，Galc and β-tubulin III.×200

圖2大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞分化后GFAP，MAP2，Galc和β-tubulin III的表達(dá)情況

Figure 2Expression of GFAP，MAP2，Galc and β-tubulin III on the differentiation of BMSCs-NSCs

表1　BDNF對(duì)骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響( ± s)

Table 1　The effects of BDNF on the differentiation of BMSC-NSCs( ± s)

表1　BDNF對(duì)骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響( ± s)

組別例數(shù)GFAP陽性率Map2陽性率Galc陽性率β-tubulinIII陽性率BDNF組962.76±2.9414.29±2.452.97±0.8213.13±2.42血清組961.78±3.546.28±0.802.79±0.627.43±1.09t 0.637 9.312 0.524 6.432P 0.533 0.000 0.607 0.000

表1顯示，BDNF能顯著提高大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞分化為Map2及β-tubulin III陽性細(xì)胞的比例，但兩組間GFAP與Galc表達(dá)陽性率無顯著差異(P>0.05)。

3討論

BMSCs是一種存在于骨髓非造血組織中的多能干細(xì)胞，它具來源豐富、取材簡(jiǎn)單、培養(yǎng)增殖容易、增殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，目前已證實(shí)骨髓基質(zhì)細(xì)胞在特定的培養(yǎng)條件下可分化成多種細(xì)胞，如神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌肉細(xì)胞和血管內(nèi)皮祖細(xì)胞等[6-8]。近年來的研究表明，BMSCs于體外通過誘導(dǎo)分化可獲得BMSCs- NSCs[2，3]。BMSCs-NSCs的成功培養(yǎng)，避免了神經(jīng)干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞等其他干細(xì)胞涉及的來源有限、取材困難、免疫排斥及倫理等問題。因此，BMSCs- NSCs在應(yīng)用神經(jīng)干細(xì)胞治療人類某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病及損傷方面具有良好的臨床應(yīng)用前景。

研究表明[9，10]，采用含bFGF和EGF的無血清培養(yǎng)基可成功將BMSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)為BMSCs-NSCs。在本實(shí)驗(yàn)中，我們選用Wistar大鼠，取大鼠骨髓，以含10%胎牛血清的DMEM/F12進(jìn)行培養(yǎng)，在成功培養(yǎng)BMSCs后。我們將BMSCs轉(zhuǎn)入含bFGF、EGF的無血清培養(yǎng)基中后，呈懸浮球狀聚集生長(zhǎng)。CD133和Nestin為目前公認(rèn)的神經(jīng)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物，通過免疫熒光檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)我們所培養(yǎng)出的細(xì)胞球均表達(dá)CD133、Nestin。因此，通過無血清懸浮培養(yǎng)法，我們成功培養(yǎng)了大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞。

低噪聲放大器的穩(wěn)定性非常重要，對(duì)其進(jìn)行精準(zhǔn)的判定是不可或缺的。一般而言，采用k檢驗(yàn)的方法[13]對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行判定，如式（4）所示：

多向分化潛能是神經(jīng)干細(xì)胞的主要特征，其可分化為中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞[11]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將呈懸浮球狀聚集生長(zhǎng)的大鼠骨髓源細(xì)胞球轉(zhuǎn)入含10%FBS的含血清培養(yǎng)基中后，其失去懸浮增殖狀態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞呈現(xiàn)多種形態(tài)，形似神經(jīng)元樣或膠質(zhì)細(xì)胞樣。細(xì)胞球分化7 d后，免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)已分化細(xì)胞可表達(dá)GFAP、Map2、Galc和β-tubulin III，證明大鼠骨髓源神經(jīng)球具備多向分化潛能，可分化為表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物的終末分化細(xì)胞，但在已分化細(xì)胞中，大部分細(xì)胞為GFAP陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞，而表達(dá)成熟神經(jīng)元標(biāo)志物Map2和未成熟神經(jīng)元標(biāo)志物β-tubulin III 的細(xì)胞僅為6.28%±0.80%和7.43%±1.09%，表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Galc的細(xì)胞比較也較低，為2.79%±0.62%。因此，在含10%FBS的培養(yǎng)條件下，BMSCs-NSCs主要向星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，而分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的數(shù)量較少。

BDNF是一種具有防止神經(jīng)元死亡功能的蛋白質(zhì)，屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族成員之一，它可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育并維持其正常功能。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，其廣泛分布在大部分腦區(qū)，上丘、大腦皮層和海馬，它對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育、存活和修復(fù)起著至關(guān)重要的作用[4，5]。有學(xué)者報(bào)道，BDNF在不同來源的神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中均顯示出重要作用，其可誘導(dǎo)NSCs向神經(jīng)元方向分化[12]。Ahmed[13]等發(fā)現(xiàn)BDNF能促進(jìn)胚鼠紋狀體來源的神經(jīng)干細(xì)胞分化為Map2陽性細(xì)胞數(shù)量，并促進(jìn)神經(jīng)突起生長(zhǎng)。Yoo等[14]發(fā)現(xiàn)，BDNF對(duì)人胚中腦來源的神經(jīng)干細(xì)胞有顯著保護(hù)作用，并可提高其向神經(jīng)元分化比率。為探索在體外條件下，BDNF是否可促使Wistar大鼠BMSCs-NSCs向神經(jīng)元方向分化，我們將BMSCs-NSCs轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基后，添加10 ng/mL BDNF。分化7 d后，進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其分化為神經(jīng)元(Map2、β-tubulin III)的比例大大提高，Map2和β-tubulin III的陽性率分別達(dá)到了14.29%±2.45%和13.13%±2.42%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，BDNF組分化為Map2和β-tubulin III陽性細(xì)胞的比較顯著高于血清組。但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，BDNF組和血清組間，星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)及少突膠質(zhì)細(xì)胞(Galc)的陽性細(xì)胞比率卻無顯著性差異，表明在體外分化條件下，BDNF可顯著促進(jìn)Wistar大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。由于本實(shí)驗(yàn)僅從體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)，BDNF雖可促進(jìn)大鼠BMSCs-NSCs向Map2和β-tubulin III陽性細(xì)胞方向分化，但這些已分化細(xì)胞是否具神經(jīng)元的功能，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，采用無血清懸浮培養(yǎng)法成功培養(yǎng)了Wistar大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞，將其轉(zhuǎn)入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行分化，并添加10 ng/mL BDNF，BDNF可顯著促進(jìn)Wistar大鼠骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化。

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