李中娥

摘要：目的 建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定痛經(jīng)靈顆粒中丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A含量的方法，為有效控制其質(zhì)量提供可靠的方法。方法 采用Welchrom C18色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）為流動(dòng)相梯度洗脫，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。結(jié)果 丹酚酸B在0.197～1.316 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（r=0.999 6），平均回收率為98.72%，RSD=1.49%；芍藥苷在0.158～1.051 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（r=0.999 8），平均回收率為99.01%，RSD=0.92%；羥基紅花黃色素A在0.053～0.353 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（r=0.999 4），平均回收率為98.34%，RSD=1.60%。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于痛經(jīng)靈顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：痛經(jīng)靈顆粒；丹酚酸B；芍藥苷；羥基紅花黃色素A；高效液相色譜法

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.025

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）01-0103-03

Simultaneous Determination of Three Active Ingredients in Tongjingling Granules by HPLC LI Zhong-e （Nanyang Institute for Food and Drug Control， Nanyang 473061， China）

Abstract： Objective To establish a simultaneous determination method for Salvianolic acid B， Paeoniflorin and Hydroxysafflor yellow A in Tongjingling Granules； To provide a reliable method for effective quality control. Methods The determination was performed on a Welchrom C18 column with acetonitrile （A） - 0.1% phosphoric acid （B） as the mobile phase in gradient elution mode at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 230 nm. Results Salvianolic acid B presented in a good linear relation in the range of 0.197–1.316 μg， and the average recovery rate was 98.72% with RSD 1.49%； Paeoniflorin presented in a good linear relation in the range of 0.158–1.051 μg， and the average recovery rate was 99.01% with RSD 0.92%； Hydroxysafflor yellow A presented in a good linear relation in the concentration range of 0.053–0.353 μg， and the average recovery rate was 98.34% with RSD of 1.60%. Conclusion This method is simple， sensitive， accurate and with good reproducibility， which can be used for quality control of Tongjingling Granules.

Key words： Tongjingling Granules； Salvianolic acid B； Paeoniflorin； Hydroxysafflor yellow A； HPLC

痛經(jīng)靈顆粒收載于《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑》第十五冊(cè)，由丹參、赤芍、香附（醋制）、蒲黃、紅花、延胡索、烏藥等組成，具有活血化瘀、理氣止痛功效，臨床用于治療氣滯血瘀所致痛經(jīng)。該產(chǎn)品現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)[1]，無(wú)法有效控制其質(zhì)量。以往報(bào)道多以原兒茶醛或芍藥苷等單一成分作為質(zhì)控指標(biāo)[2-3]，本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)[4-8]，對(duì)樣品處理方法和色譜分離系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化，采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)對(duì)方中3味主藥的特征性活性成分丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A含量進(jìn)行測(cè)定，從而在簡(jiǎn)化檢測(cè)步驟、節(jié)約檢測(cè)資源的情況下，更好地控制該藥品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀，配四元梯度泵、G1314F紫外檢測(cè)器；賽多利斯BP-211D電子天平；KQ-300DE型數(shù)控超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

對(duì)照品丹酚酸B（批號(hào)111562-201110，含量98.0%）、芍藥苷（批號(hào)110736-201035，含量96.5%）、羥基紅花黃色素A（批號(hào)111637-200905，含量91.8%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，乙腈（HPLC，Welch Materials Inc.），磷酸（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠），水為重蒸餾水。痛經(jīng)靈顆粒（市售）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welchrom C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～12 min，12%A；12～20 min，12%A→34%A；20～30 min，34%A；30～35 min，34%A→12%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)算應(yīng)不低于4000，各峰之間分離度符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取羥基紅花黃色素A對(duì)照品9.62 mg，置50 mL量瓶中，加75%甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密稱(chēng)取丹酚酸B對(duì)照品16.78 mg、芍藥苷對(duì)照品13.61 mg，置25 mL量瓶中，加上述羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得含丹酚酸B 0.657 8 mg/mL、芍藥苷0.525 3 mg/mL、羥基紅花黃色素A 0.176 6 mg/mL的溶液（對(duì)照品溶液①），精密量取2 mL，置20 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取本品適量，研細(xì)，精密稱(chēng)取0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加75%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提?。?50 W，40 kHz）30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，用微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液制備 按處方制法分別制備不含丹參、赤芍和紅花的陰性對(duì)照樣品，按供試品溶液制備方法分別制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果供試品色譜中，在與丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A對(duì)照品色譜相同的保留時(shí)間處有色譜峰，與其他組分能達(dá)到良好分離，分離度均>1.5，理論塔板數(shù)分別為8326、10 967、13 980。陰性對(duì)照色譜中，在與丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A對(duì)照品色譜峰相應(yīng)的位置上無(wú)干擾峰，說(shuō)明供試品溶液中的其他成分對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響，見(jiàn)圖1。

2.4 線(xiàn)性關(guān)系的考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液① 0.3、0.6、0.9、1.2、1.6、2.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得回歸方程。丹酚酸B：Y=10.866X-1.100 9，r=0.999 6（n=6）。芍藥苷：Y=7.621X+0.292 1，r=0.999 8（n=6）。羥基紅花黃色素A：Y=11.834X-0.352 8，r=0.999 4（n=6）。結(jié)果表明，丹酚酸B在0.197～1.316 μg、芍藥苷在0.158～1.051 μg、羥基紅花黃色素A在0.053～0.353 μg范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果丹酚酸B、芍藥苷和羥基紅花黃色素A的峰面積RSD分別為0.97%、1.56%、1.22%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定每份樣品中3種成分含量，結(jié)果丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A的含量RSD分別為1.33%、0.91%、1.52%，說(shuō)明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供品溶液，分別在0、3、6、9、12 h進(jìn)樣測(cè)定峰面積，結(jié)果丹酚酸B、芍藥苷、羥基紅花黃色素A的峰面積RSD分別為1.59%、1.13%、1.27%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已測(cè)得含量（丹酚酸B 2.628 mg/g，芍藥苷2.083 mg/g，羥基紅花黃色素A 0.706 mg/g）的痛經(jīng)靈顆粒6份，每份0.25 g，分別精密加入“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液①各1.0 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9 樣品測(cè)定

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件，測(cè)定來(lái)自云南、河北、陜西、吉林不同廠家共12批樣品中3種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

根據(jù)12批樣品所測(cè)得的結(jié)果，可看出不同廠家不同批次所含3種成分的含量有所差異，質(zhì)量參差不齊，其中尤以羥基紅花黃色素A的含量差別為大，可能與紅花藥材較貴且在成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中較少被檢測(cè)有關(guān)，因此很有必要對(duì)這3種成分合理定量，從而更好地監(jiān)管該藥品的質(zhì)量。

3 討論

本試驗(yàn)比較了30%乙醇、甲醇、50%甲醇及75%甲醇幾種溶劑的提取效果，結(jié)果以75%甲醇提取所得可更好兼顧3種成分的含量，故以75%甲醇為提取溶劑。因丹酚酸B對(duì)熱不太穩(wěn)定，故未采用回流而采用超聲方式提取，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)超聲提取25 min后，3種成分的含量無(wú)明顯增加，所以將提取時(shí)間定在30 min。

在多成分同時(shí)檢測(cè)中，很多需要采用轉(zhuǎn)換波長(zhǎng)的方式以取得好的效果[5-6]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以芍藥苷的最大吸收波長(zhǎng)230 nm作為單一檢測(cè)波長(zhǎng)，其他2種成分亦吸收穩(wěn)定，響應(yīng)信號(hào)良好，線(xiàn)性范圍滿(mǎn)足需要，故采用單波長(zhǎng)檢測(cè)，便于該方法更廣泛地應(yīng)用。

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（收稿日期：2014-12-02；編輯：陳靜）