陳娉婷 周小青 劉旺華 曹澤標 陳昱文 李花

摘要：目的 觀察丹龍醒腦方對腦缺血再灌注模型大鼠側腦室室管膜下區(qū)（SVZ）神經干細胞（NSCs）增殖與Hes1、Hes5表達的影響，探討其促進內源性NSCs增殖的作用機制。方法 將80只雄性SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、依達拉奉組（依達組）、丹龍醒腦方組（丹龍組）。采用線栓法制備局灶性腦缺血再灌注模型，再灌注7 d后取缺血側SVZ腦組織。Brdu免疫熒光法檢測SVZ NSCs增殖，RT-qPCR、Western blot分別檢測Hes1、Hes5 mRNA和蛋白的表達。結果 與假手術組比較，其余各組Brdu陽性細胞率增加，Hes1、Hes5 mRNA及蛋白表達明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，依達組、丹龍組Brdu陽性細胞率明顯增加，Hes1、Hes5 mRNA及蛋白表達水平明顯增強（P<0.01）；丹龍組Hes1 mRNA表達水平優(yōu)于依達組（P<0.01），其余指標均無明顯差異。結論 丹龍醒腦方可促進腦缺血再灌注后大鼠SVZ NSCs增殖，并上調Hes1、Hes5表達水平，其機制可能與激活Notch信號通路有關。

關鍵詞：丹龍醒腦方；室管膜下區(qū)；神經干細胞；增殖；Hes1；Hes5；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.016

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）01-0069-05

Effects of Danlong Xingnao Formula on Proliferation of Neural Stem Cells in Sub Ventricular Zone and Expressions of Hes1 and Hes5 in Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury Model Rats CHEN Ping-ting1，2， ZHOU Xiao-qing1，2，3， LIU Wang-hua1，2，3， CAO Ze-biao1，2， CHEN Yu-wen1，2， LI Hua1，2，3 （1. Institute of Diagnostics Traditional Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2. The Key Laboratory of Diagnostics of Chinese Medicine in Hunan Province， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China； 3. Collaborative Center for Research and Innovation of Digital Chinese Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

Abstract： Objective To study effects of Danlong Xingnao Formula （DLXNF） on proliferation of neural stem cells （NSCs） and the expressions of Hes1 and Hes5 in sub ventricular zone （SVZ） in cerebral ischemia-reperfusion injury model rats； To explore the mechanism of promoting the proliferation of NSCs Methods Eighty male SD rats were randomly divided into sham-operation group， model group， edaravone group and DLXNF group. The focal cerebral ischemia reperfusion injury models were prepared by suture method， and 7 d after reperfusion， the SVZ brain tissue of ischemia side was taken. The proliferation of cells was detected by Brdu labeling fluorescence immunocytochemistry； Hes1， Hes5 mRNA and protein expressions were detected by fluorescence real-time quantitative PCR and Western blot method in each group. Results Compared with the sham-operation group， Brdu positive cell rate in other groups increased more obviously， and the expressions of Hes1， Hes5 mRNA and protein also increased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， Brdu positive cell rate increased significantly in edaravone group and DLXNF group， and the expressions of Hes1， Hes5 mRNA and protein increased significantly

（P<0.01）. The expression of Hes1 mRNA in DLXNF group was superior to that in edaravone group （P<0.01）， and other indexes had no significant difference. Conclusion DLXNF can promote the proliferation of NSCs in SVZ in cerebral ischemia-reperfusion injury model rats， and up-regulate the expressions of Hes1 and Hes5， whose mechanism may be related to the activation of Notch signaling pathway.

Key words： Danlong Xingnao Formula； sub ventricular zone； neural stem cell； proliferation； Hes1； Hes5； rats

腦卒中已成為當前威脅人類健康的第二大病因，其中缺血性腦卒中的發(fā)病率約占全部腦卒中2/3[1]，具有發(fā)病率、病死率和致殘率“三高”的特點。腦缺血后，神經元大量丟失導致腦功能障礙，遺留不同程度的神經功能缺損癥狀甚至肢體癱瘓。神經干細胞（neural stem cells，NSCs）的發(fā)現(xiàn)使之成為腦缺血后神經再生研究的新靶點。目前研究表明，腦缺血損傷能促使腦內NSCs激活后增殖、遷移和分化，參與神經再生和腦組織功能的恢復[2]。同時該過程受多種細胞信號通路和因子的調控，在中樞神經系統(tǒng)中，Wnt與Notch信號通路是NSCs增殖作用機制的研究熱點[3]。丹龍醒腦方是湖南中醫(yī)藥大學周小青教授治療缺血性腦血管病有效復方，功擅活血通絡、化痰開竅、補腎生髓。前期實驗研究顯示，本方能干預腦缺血后級聯(lián)反應多環(huán)節(jié)，保護腦功能以促進神經恢復[4]，促進神經營養(yǎng)因子及干細胞增殖，并且可能與激活Wnt/β-catenin信號通路有關[5-6]。本實驗采用線栓法制備腦缺血再灌注大鼠模型，觀察再灌注7 d后大鼠側腦室室管膜下區(qū)（sub ventricular zone，SVZ）NSCs增殖，以及對Notch信號通路的重要效應分子Hes1、Hes5表達的影響，進一步探討本方對腦缺血后促進內源性NSCs增殖的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性2月齡清潔級SD大鼠120只，體質量250～300 g，湖南斯萊克景達動物實驗公司提供，許可證號SCXK（湘）2013-0005。適應性喂養(yǎng)7 d后開始造模。

1.2 藥物

丹龍醒腦方由丹參15 g、三七12 g、地龍6 g、遠志15 g、石菖蒲12 g、淫羊藿10 g、菟絲子12 g組成，飲片購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院。浸泡30 min，首煎加6倍水，水沸后文火煎60 min，第2煎加3倍水，水沸后文火煎30 min，2次藥汁混合，過濾，于水浴鍋內蒸發(fā)濃縮為含原藥材1.6 g/mL，滅菌分裝，4 ℃冰箱冷藏。依達拉奉注射液，國瑞藥業(yè)有限公司，批號80-140118。

1.3 主要試劑與儀器

5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu），Sigma；Brdu抗體（ab6326）、Hes1兔源性多克隆抗體（2922-1），EPI；Hes5兔源性多克隆抗體（194111），abcam；熒光二抗CY3-山羊抗小鼠抗體（115-165-003）、HRP標記山羊抗兔抗體（GB23303）、Actin兔源性多克隆抗體（GB13001-1），武漢谷歌生物科技公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（#K1622），Thermo；引物（Invitrogen Biotechnology Co，LTD）；Trizol試劑盒（15596-026），Invitrogen Life Technologies。7300型熒光定量PCR儀（ABI），倒置熒光顯微鏡及彩色圖像分析系統(tǒng)（NIKON），AlphaEase FC專業(yè)灰度分析軟件（Innotech），線身直徑為0.28 mm成品MCAO線栓若干（北京西濃科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 分組

80只大鼠被毛染色法編號，按隨機數(shù)字表法隨機分為假手術組12只和模型制備組68只。因本實驗模型存在一定死亡率，模型制備組于造模后，根據(jù)神經功能評分等級采取分層抽樣的形式均分為模型組、依達拉奉組（依達組）、丹龍醒腦方組（丹龍組），每組12只。

2.2 局灶性腦缺血再灌注模型制備及評價

參考文獻[7]方法，復制局灶性腦缺血再灌注大鼠模型。10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，仰臥位固定于實驗臺上，頸部常規(guī)備皮消毒，頸正中切口，分離左側頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）、頸外動脈（ECA）。結扎CCA近心端及ECA，在CCA結扎上近心端約0.5 cm處剪一切口，將線栓蘸取肝素后，由切口向頸內動脈緩慢插入ICA，向入顱方向推進，至有輕微阻力感停止[（18.0±0.5）mm]，扎緊并固定線栓，縫合皮下組織和皮膚。記錄插線時間，插線2 h后再次將大鼠麻醉，用直頭鑷夾住露出皮膚的栓線尾部柔和緩慢抽出，當栓線球前端遇到頸內動脈結扎線時會有阻力，即停止拔線，剪除栓線的殘余末端。假手術組僅分離動脈，不插線栓，全過程同其余組。術后再灌注24 h動物完全清醒后，采用Zea-Longa等5分制評分標準進行神經功能缺損評分并記錄[7]，評分為1～3者為成功模型，評分后按前述要求進行分組。

2.3 給藥及取材

大鼠再灌注24 h后開始給藥，每日1次，連續(xù)給藥7 d。丹龍組每日給藥劑量按70 kg成人每日服用82 g原藥材劑量進行換算[8]，得出每日原藥材劑量約為7.4 g/kg。依達組每日給藥劑量約為3.2 mg/kg，用0.9%氯化鈉溶液配制腹腔注射給藥。假手術組和模型組予等體積蒸餾水灌胃。每組取6只于第7日給藥2 h后，10%水合氯醛麻醉，頸動脈處死后迅速斷頭取腦，冰上快速分離缺血側SVZ腦組織，行實時熒光定量PCR（RT-qPCR）、Western blot檢測。其余大鼠于術后24 h給予腹腔注射Brdu 100 mg/kg，1次/d，連續(xù)7 d。于第7日注射藥物2 h后，麻醉，常規(guī)生理鹽水、4%多聚甲醛心臟灌流至肝臟變硬后斷頭，迅速取缺血側SVZ腦組織，放入4%多聚甲醛固定液中，脫水、透明、浸蠟，在視交叉前后連續(xù)制作厚度為5 ?m腦部冠狀切片，用于免疫熒光法檢測。

2.4 指標檢測

2.4.1 免疫熒光法檢測室管膜下區(qū)神經干細胞增殖 常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2-甲醇室溫孵育30 min，微波修復，10%羊血清濕盒內37 ℃孵育30 min，一抗Brdu抗體1∶100稀釋，濕盒內4 ℃孵育過夜，二抗CY3-羊抗兔IgG 1∶300稀釋，濕盒內37 ℃孵育45 min，DAPI復染細胞核。各步均用PBS震蕩漂洗3次，防淬滅劑封片，倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。細胞核染色為藍色，細胞核出現(xiàn)紅色熒光者為Brdu陽性細胞，隨機觀察5個不重疊高倍視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)及總細胞數(shù)，計算陽性細胞百分率（陽性細胞數(shù)÷總細胞數(shù)×100%）。陽性細胞百分率越高表示增殖細胞越多。

2.4.2 PCR檢測室管膜下區(qū)Hes1、Hes5 mRNA表達 分離0.1 g SVZ腦組織，應用Trizol試劑盒提取總RNA，以紫外分光光度計A280、A260定量測定濃度；將總RNA經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，可見明顯的2條區(qū)帶（28 s、18 s），證明其完整性。以組織總mRNA，反轉錄合成cDNA，60 ℃退火，用SYBR法進行RT-qCR。Taq酶催化，95 ℃預熱10 min后，40個PCR循環(huán)。采用2-ΔΔCt法，以2-ΔΔCt值反映目的基因表達水平，其數(shù)值越大，基因表達越強。各基因引物序列見表1。

2.4.3 Western blot檢測室管膜下區(qū)Hes1、Hes5蛋白表達 SVZ腦組織經蛋白質抽提劑提取蛋白，行SDS-PAGE電泳，轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉1 h。一抗4 ℃過夜，Hes1及β-actin稀釋比例均為1∶1000，Hes5稀釋比例為1∶2000；洗膜后加入HRP標記的二抗山羊抗兔抗體，稀釋比例為1∶3000，室溫孵育1 h，加ECL膠片曝光后用AlphaEase FC軟件分析自身灰度值，以目的蛋白條帶灰度與管家蛋白β-actin條帶灰度的比值表示蛋白表達水平。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示。多組間比較采用方差分析，方差齊時選用LSD法，方差不齊時采用Tamhane's T2檢驗法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結果

4.1 丹龍醒腦方對大鼠室管膜下區(qū)神經干細胞增殖的影響

與假手術組比較，其余各組SVZ Brdu陽性細胞率明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，依達組、丹龍組Brdu陽性細胞率明顯增加（P<0.01）；丹龍組與依達組比較差異無統(tǒng)計學意義，見圖1、表2。

4.2 丹龍醒腦方對大鼠室管膜下區(qū)Hes1、Hes5 mRNA表達的影響

與假手術組比較，其余各組Hes1、Hes5 mRNA表達明顯增強（P<0.01）；與模型組比較，依達組、丹龍組Hes1、Hes5 mRNA表達明顯增強（P<0.01）；依達組與丹龍組比較，Hes1 mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而Hes5 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義，見表3。

4.3 丹龍醒腦方對大鼠室管膜下區(qū)Hes1、Hes5蛋白表達的影響

與假手術組比較，其余各組Hes1、Hes5蛋白表達明顯增強（P<0.01）；與模型組比較，依達組、丹龍組Hes1、Hes5蛋白表達明顯增強（P<0.01）；依達組與丹龍組比較差異無統(tǒng)計學意義，見表3、圖2。

5 討論

NSCs廣泛存在于神經系統(tǒng)，在成年哺乳動物中樞神經系統(tǒng)存在2個聚集區(qū)：海馬齒狀回的顆粒下層和SVZ[9]。NSCs生理狀態(tài)下多處于“靜息”狀態(tài)，在缺血或創(chuàng)傷性損傷刺激下，NSCs可被激活，通過對稱或不對稱分裂增殖，進一步分化成熟為神經元、膠質細胞或少突膠質細胞，并遷移到大腦皮質的顆粒層，最終整合到神經元網絡中修復神經損傷，即神經再生。然而內源性NSCs的增殖數(shù)量有限，不足以進行自我代償和修復。因此，促進內源性NSCs活化，恢復和重建神經功能成為目前神經科學研究的熱點。研究表明，腦缺血后的神經再生受多種調節(jié)因子和信號通路的調控，主要有Notch、Wnt、Shh信號通路等。各信號通絡之間并非孤立的，而是相互緊密聯(lián)系，共同構成了一個影響神經再生的精密網絡調控系統(tǒng)[3]。Notch信號通路是通過相鄰細胞4種Notch受體（Notch1～4）與5種配體（Jagged1、2和Delta1、3、4）的結合，引起受體多次水解后釋放其胞內域（NICD）而活化，NICD與CLS DNA結合蛋白結合后激活下游的效應分子，主要是Hes等靶基因[10]。Hes屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子家族，包括Hes1～7共7個同源基因，其中Hes1/5是Notch信號通路的重要效應分子，在干細胞的增殖、分化過程中扮演重要角色。上調Hes1表達可抑制NSCs分化為神經元，促進增殖，若Hes1基因的缺失，可見神經元的分化明顯增加[11]。Hes5也是各調控因子調控NSCs增殖的目的基因。如果敲除Notch的效應分子Hes1、Hes5，可明顯觀察到中樞神經系統(tǒng)內幾乎所有的NSCs都過早地分化為神經元[12]。因此，Hes1、Hes5對調控NSCs增殖具有重要作用，能反映Notch通路的激活狀態(tài)。

有研究顯示，成年大鼠腦缺血后NSCs增殖在7～10 d達高峰[13]，之后逐漸回落。Notch信號通路在正常情況下低表達，而腦缺血后可促進其通路組分的表達[14]。本研究采用線栓法成功建立MCAO/R大鼠模型，通過Brdu免疫熒光法觀察腦缺血再灌注7 d后丹龍醒腦方對大鼠SVZ NSCs增殖，并檢測Hes1、Hes5 mRNA和蛋白表達，探討Notch信號通路在其中的調控作用。實驗結果顯示，丹龍醒腦方干預后在缺血后SVZ NSCs增殖明顯增多，即陽性細胞率增加，與之前研究結果一致[6]；與假手術組、模型組比較，丹龍組和依達組Brdu陽性細胞率明顯增加，同時Hes1、Hes5蛋白及mRNA的表達明顯增強，且不同分子水平其趨勢基本一致，提示丹龍醒腦方可上調SVZ Hes1、Hes5表達水平，促進NSCs增殖的機制可能與調控Notch信號通路有關。此外，各條信號通路之間存在復雜網絡聯(lián)系，已知Hes1、Hes5是Notch信號通路主要靶基因，而其他信號通路也可能通過交叉網絡間接發(fā)揮作用。比如Notch通路與Wnt、Shh等信號通路存在的“crosstalk”（串話）[3]，Notch與Wnt兩通路之間關系復雜，既相互制約又相互促進，Wnt途徑的激活減少Notch信號通路下游靶基因Hes1、Hes5的表達；Notch的激活又降低β-catenin積累，通過內吞接頭蛋白Numb抑制Wnt通路[15]。Shh信號通路可以通過Smo調控Hes1的表達，Hes1是聯(lián)系Notch及Shh信號通路的一個重要網絡節(jié)點[16]。因此，有待下一步探討本方對Notch信號通路上的受體、配體及其他相關分子的表達水平，進一步驗證是否激活Notch信號通路。

丹龍醒腦方中丹參為君，田七、遠志、石菖蒲為臣，佐以地龍、淫羊藿、菟絲子。全方通補兼施，以通為主，共奏活血通絡、化痰開竅、補腎生髓之功。孟氏等[17]研究顯示，益氣活血方和補腎生髓方能通過增強缺血側額頂葉皮質Hes1和Hes5的表達，調節(jié)Notch信號轉導通路，促進內源性NSCs增殖，與本實驗結果一致。另外，現(xiàn)代藥理研究表明，大鼠腦缺血后應用丹參酮[18]、三七總皂苷[19]、淫羊藿及其提取物[20]等均能促進NSCs增殖。

綜上所述，丹龍醒腦方能促進腦缺血后SVZ NSCs增殖，其機制與通過上調Hes1、Hes5水平有關，可能通過激活Notch信號通路來實現(xiàn)。但由于γ-分泌肽酶抑制劑DAPT（Notch通路阻滯劑）有明顯腸道毒性，且參與體內多個信號系統(tǒng)的調節(jié)，其應用造成如癡呆樣的不良反應，嚴重干擾實驗的觀察。因此，本研究未設置Notch通路抑制劑對照組，有待今后體外研究進一步驗證。該通路上游的配體和受體等其他組成成分表達情況未進行觀察，與Notch通路直接相關及相關的程度也有待今后進一步研究。

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（收稿日期：2015-08-10；編輯：華強）