楊杰 衛(wèi)東鋒 王文瀟 程衛(wèi)東

摘要：目的 觀察五指毛桃藥物血清對老齡小鼠衰老所致脾淋巴細胞氧化損傷的影響，探討其作用機制。方法 將40只老齡小鼠隨機分為空白對照組和五指毛桃高、中、低劑量組，分別給予0.9%氯化鈉溶液和6.6、4.4、2.2 g/kg五指毛桃水提物灌胃，測定脾臟指數(shù)，確定五指毛桃水提物的最佳劑量，采用MTT法確定最佳劑量藥物血清干預(yù)老齡小鼠脾淋巴細胞增殖的最佳稀釋濃度及最佳作用時間。使用最佳稀釋濃度藥物血清作用老齡小鼠脾淋巴細胞48 h后觀察衰老細胞陽性率，檢測細胞內(nèi)總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性、丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）含量。結(jié)果 與空白對照組比較，藥物組老齡小鼠脾臟指數(shù)均明顯提高（P<0.05，P<0.01），以中劑量組效果最佳；五指毛桃藥物血清促進老齡小鼠脾淋巴細胞增殖的最佳濃度為20%，最佳作用時間為48 h。20%五指毛桃藥物血清明顯降低衰老細胞陽性率（P<0.01），提高老齡小鼠T-SOD活性，降低MDA和ROS含量（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 五指毛桃藥物血清能夠提高老齡小鼠脾淋巴細胞增殖活性，其機制與降低衰老細胞陽性率、增強細胞抗氧化能力有關(guān)。

關(guān)鍵詞：五指毛桃；藥物血清；脾淋巴細胞；衰老；氧化損傷；老齡小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.012

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）01-0052-04

Effects of Drug-containing Serum of Ficus Hirta on Oxidative Damage of Spleen Lymphocyte in Aged Mice YANG Jie1，2， WEI Dong-feng3， WANG Wen-xiao2， CHENG Wei-dong1 （1. Institute of Traditional Chinese Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China； 2. School of Basic Medical Science of Lanzhou University， Lanzhou 730000， China； 3. Institute of Basic Research in Clinical Medicine， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

Abstract： Objective To study the effects of drug-containing serum of Ficus Hirta on oxidative damage of spleen lymphocyte due to aging in aged mice； To discuss its mechanism of action. Methods Forty aged mice were randomly divided into control group and high-， medium- and low-dose Ficus Hirta groups. Control group was given 0.9% sodium chloride solution for gavage， while high-， medium- and low-dose Ficus Hirta groups were given 6.6， 4.4， and 2.2 g/kg aqueous extract of Ficus Hirta for gavage. The spleen index was observed for optimum dose in aged mice. The optimum time and dilution of drug-containing serum of Ficus Hirta were confirmed by MTT method in lymphocyte proliferation test. The positive rate of senescent cells， the activity of T-SOD and the contents of MDA and ROS were determined in cellular antioxidant experiment after treated by optimal drug-containing serum for 48 h. Results Compared with the control group， the spleen index was significantly improved in high-， medium- and low-dose Ficus Hirta groups （P<0.05， P<0.01）. 20% drug-containing serum of Ficus Hirta cultivated for 48 h had the best effects on lymphocyte proliferation in aged mice. 20% drug-containing serum of Ficus Hirta could significantly decrease the positive rate of senescent cells （P<0.01）， improve T-SOD activity and decrease the contents of MDA and ROS （P<0.05， P<0.01）. Conclusion The drug-containing serum of Ficus Hirta can improve the proliferative activity of spleen lymphocyte in aged mice and the mechanism of action may be involved in decreasing the positive rate of senescent cells and increasing antioxidant ability of lymphocyte.

Key words： Ficus Hirta； drug-containing serum； spleen lymphocytes； aging； oxidative damage； aged mice

五指毛桃以?？崎艑僦参锎秩~榕Ficus hirta Vahl.的干燥根入藥，其味甘、辛，性平，具有補氣健脾、利濕舒筋等功效，常用于治療肺脾氣虛、風(fēng)濕痹痛、肺癆咳嗽等。因其與黃芪作用相當，且主要產(chǎn)于我國嶺南地區(qū)，故又稱“南芪”。以往研究發(fā)現(xiàn)，南芪、北芪均有增強小鼠細胞免疫力的作用，但南芪作用效果較為顯著[1]。五指毛桃中活性成分如黃酮、多糖、多酚、氨基酸均有較強清除自由基的作用，且其中黃酮、氨基酸和多酚相對于其他植物抗氧化活性更強[2]，對機體氧化損傷具有明顯的保護作用。本實驗采用血清藥理學(xué)方法，觀察五指毛桃藥物血清對老齡小鼠脾淋巴細胞氧化損傷的影響，為五指毛桃的臨床應(yīng)用及藥物研發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物

清潔級昆明種青齡小鼠50只，6月齡，雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g；清潔級昆明種老齡小鼠60只，18月齡，體質(zhì)量（20±2）g，雌雄各半。均由蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)動物實驗中心提供，許可證號SCXK（甘）2009-0004。飼養(yǎng)溫度為（20±2）℃，12 h晝夜交替動物房中，自由進食。

1.2 藥物

五指毛桃由南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院程衛(wèi)東教授提供并鑒定。五指毛桃水提物制備：將藥材加入適量水中浸泡0.5～1 h，煎煮3次，第1次1.5 h，第2次1 h，第3次0.5 h，合并3次濾液，將所得濾液濃縮至1 g原藥材/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

四甲基偶氮唑鹽（MTT）、刀豆蛋白A（ConA）、脂多糖，美國Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，恒生生物工程有限公司；十二烷基磺酸鈉（SDS），天津化學(xué)試劑一廠；EZ-SepTM小鼠淋巴細胞分離液，深圳達科為生物技術(shù)有限公司；胎牛血清，杭州四季青生物制品公司；Bradford蛋白濃度測定試劑盒、細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、細胞內(nèi)活性氧（ROS）試劑盒，南京建成生物工程研究所。CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司），680型酶標儀（美國Bio-Rad公司），XL型流式細胞儀（美國貝克曼COULTER公司），JY92-2D超聲細胞粉碎機（寧波新芝公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及藥物血清和脾淋巴細胞懸液制備

將40只老齡小鼠隨機分為空白對照組和五指毛桃高、中、低劑量組，每組10只?？瞻讓φ战M給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，藥物組按體質(zhì)量分別給予高、中、低劑量（6.6、4.4、2.2 g/kg）五指毛桃水提物灌胃，1次/d，連續(xù)15 d。末次給藥后，摘取脾臟，計算脾臟指數(shù)。根據(jù)脾臟指數(shù)選擇五指毛桃水提物最佳劑量（4.4 g/kg）作用于青齡小鼠，1次/d，連續(xù)15 d，末次給藥2 h后，制備藥物血清[3]。

將青齡小鼠和老齡小鼠脫頸處死，無菌取脾臟，嚴格按照EZ-SepTM小鼠淋巴細胞分離物說明書操作提取脾淋巴細胞，各加入適量含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，分別調(diào)整為所需濃度，制備青齡小鼠和老齡小鼠的脾淋巴細胞懸液。

2.2 檢測指標

2.2.1 五指毛桃藥物血清與脾淋巴細胞增殖時效和量效關(guān)系測定 將上述制備的老齡小鼠脾淋巴細胞懸液，加入96孔板中，每孔100 μL。將“2.1”項中制備的各組藥物血清用完全RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋為2.5%、5%、10%、20%、40% 5個濃度。每個濃度設(shè)8個復(fù)孔，同時設(shè)不加藥物血清的老齡組和青齡組作為對照，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，加入濃度5 g/mL MTT 10 μL，于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，每孔加入100 μL 10%SDS，37 ℃過夜后搖勻，于酶標儀570 nm處測定OD值。根據(jù)MTT結(jié)果選擇藥物血清的最佳稀釋濃度和培養(yǎng)時間。

2.2.2 衰老脾淋巴細胞增殖活性測定 取各組脾淋巴細胞按照細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書進行操作。鏡下隨機選擇5個視野，按公式計算衰老細胞陽性率。衰老細胞陽性率（%）=衰老細胞數(shù)÷總細胞數(shù)×100%。

2.2.3 脾淋巴細胞總超氧化物歧化酶、丙二醛水平測定 將“2.1”項中收集的老齡小鼠脾淋巴細胞與最佳稀釋濃度的藥物血清培養(yǎng)“2.2.1”項中確定的最佳培養(yǎng)時間后，收集細胞，用超聲波細胞破碎儀在冰上破碎細胞，嚴格按照T-SOD和MDA試劑盒說明書進行操作。

2.2.4 脾淋巴細胞活性氧水平測定 將“2.1”項收集的老齡小鼠脾淋巴細胞與各組藥物血清共同培養(yǎng)。收集的細胞嚴格按照ROS試劑盒說明書處理后，用流式細胞儀于488 nm激發(fā)波長、525 nm發(fā)射波長處檢測其熒光強度。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，并做方差齊性檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 五指毛桃水提物對老齡小鼠脾臟指數(shù)的影響

與空白對照組比較，五指毛桃高、中劑量組老齡小鼠脾臟指數(shù)明顯提高，且中劑量組效果顯著（P<0.01），見表1。故選用中劑量五指毛桃水提物給予青齡小鼠灌胃制備藥物血清。

4.2 五指毛桃藥物血清對老齡小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響

與老齡組比較，稀釋濃度為10%、20%、40%五指毛桃藥物血清均能明顯提高老齡小鼠脾淋巴細胞增殖活性（P<0.05，P<0.01），并呈現(xiàn)一定的時-效和量-效關(guān)系。隨著細胞培養(yǎng)時間的延長，脾淋巴細胞的增殖活性呈現(xiàn)先升后降的現(xiàn)象；空白血清稀釋濃度為20%和40%時，也可提高老齡小鼠脾淋巴細胞細胞增殖活性，但仍比五指毛桃藥物血清組水平低。與空白血清組比較，培養(yǎng)48 h，稀釋濃度為20%五指毛桃藥物血清對脾淋巴細胞增殖的刺激效果最佳（P<0.01），見表2。因此，將稀釋濃度為20%、培養(yǎng)時間為48 h的五指毛桃藥物血清作為后續(xù)實驗研究的條件。