牛蒡苷通過激活p38 MAPK抑制舌癌Tca8113細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究*

于四海嚴(yán)曉峰

(重慶市公共衛(wèi)生醫(yī)療救治中心口腔科， 重慶 400036)

【摘要】目的探討牛蒡子苷對于人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)的分子機(jī)制。方法將Tca8113細(xì)胞分為對照組(Control組)、牛蒡苷干預(yù)組(ATG干預(yù)組)及牛蒡苷+p38 MAPK抑制劑SB203580組(ATG+SB組)3組。使用MTT法對不同時(shí)間點(diǎn)(0 h，24h和72h)各組Tca8113細(xì)胞活性進(jìn)行檢測；使用western blot法對干預(yù)24小時(shí)后Tca8113細(xì)胞的p38 MAPK的活化水平及caspase-3的活化水平進(jìn)行分析。結(jié)果與對照組相比，給予牛蒡苷干預(yù)的Tca8113細(xì)胞活性呈時(shí)間依賴性下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，且各時(shí)間點(diǎn)ATG組較ATG+SB組細(xì)胞活性下降程度更加明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。干預(yù)24小時(shí)后，給予牛蒡苷干預(yù)的Tca8113細(xì)胞p38 MAPK及caspase-3的活化水平均有顯著的上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；但ATG組較ATG+SB組細(xì)胞p38 MAPK及caspase-3的活化水平上升更加明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。結(jié)論牛蒡苷可以通過激活p38 MAPK促進(jìn)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞caspase-3的活化，從而抑制Tca8113細(xì)胞的增殖。本實(shí)驗(yàn)為牛蒡子苷應(yīng)用于舌癌和其他腫瘤的臨床治療奠定了一定的基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】Tca8113細(xì)胞； 牛蒡子苷； P38 MAPK； Caspase-3

【中圖分類號】R 329.2+8【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

基金項(xiàng)目：國家“十二五”科技重大專項(xiàng)課題(2012zx10005-008)

通訊作者：嚴(yán)曉峰，E-mail：yanxiaofeng2015@tom.com

收稿日期：( 2014-09-11； 編輯： 張文秀)

Arctigenin inhibits the proliferation of tongue cancer Tca8113 cells by activation of p38 MAPKYU Sihai, YANG Xiaofeng

(DepartmentofStomatology,ChongqingPublicHealthMedicalCenter,Chongqing400036,China)

Abstract【】ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of arctigenin on the proliferation of tongue cancer Tca8113 cells and its potential mechanism. MethodsTca8113 cells were divided into 3 groups including control group, arctigenin (ATG) group and arctigenin+SB203580 group (ATG+SB) group. MTT was used to analyze the cell viabilities of Tca8113 cells in different time points at 0h, 24h and 72h. 24 hours after interventions, the activation of p38 MAPK and caspase-3 were measured by Western blot.ResultsThe cell viabilities of Tca8113 cells were time-dependently reduced by ATG treatment. However, SB203580 blunted this effect of ATG. 24 hours after intervention, the activation of p38 MAPK and caspase-3 were noticeably increased by ATG. Meanwhile, we also found that these effects of ATG were largely abrogated by SB203580. ConclusionThe proliferation were inhibited by arctigenin (ATG) through activation of p38 MAPK/caspase-3 pathway in tongue cancer Tca8113 cells.

【Key words】Tca8113 cells; Arctigenin; P38 MAPK; Caspase-3

舌癌是口腔惡性腫瘤中最常見的類型，同時(shí)流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)由于人口老齡化和飲食結(jié)構(gòu)的改變舌癌等口腔癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且有年輕化的傾向[1～3]。p38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子，大量研究證實(shí)p38 MAPK活化水平對于包括肺癌、結(jié)腸癌和宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、血管生成和腫瘤凋亡有重要的調(diào)控作用[4-7]。牛蒡苷(Arctigenin, ATG)是中藥牛蒡子的最主要的藥理成分，研究發(fā)現(xiàn)牛蒡苷具有解熱鎮(zhèn)痛、抑制炎癥反應(yīng)和抑制腫瘤的作用[8-12]。近期研究證實(shí)牛蒡苷的藥理作用與促進(jìn)p38 MAPK活化密切相關(guān)[12]。本研究擬觀察牛蒡苷對于人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞增殖的影響和相關(guān)的分子機(jī)制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞株從中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫購買；牛蒡苷和p38 MAPK抑制劑SB203580均購買于美國Sigma公司；鼠抗人phospho-p38 MAPK抗體、鼠抗人p38 MAPK抗體、鼠抗人caspase-3抗體和鼠抗人β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司。DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純，美國Tedia公司)，DMSO (二甲基亞砜，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。其余試劑均為分析純。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清，100 g/L青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃，5 % CO2，孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每72h換液、傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。Tca8113細(xì)胞分為對照組(Control組)、牛蒡苷干預(yù)組(ATG組)及牛蒡苷+p38 MAPK抑制劑SB203580組(ATG+SB組)，共3組。其中對照組細(xì)胞加入PBS；ATG組和ATG+SB組細(xì)胞加入牛蒡苷(終濃度40μM)；同時(shí)ATG+SB組加入SB203580 (終濃度10μM)。使用MTT法對干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)(0h、24h和48 h)的細(xì)胞活性進(jìn)行測定，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性(%) = (樣本OD值/對照組OD值) × 100 (%)[13]。

1.3Western blot法檢測細(xì)胞中caspase-3、phospho-p38 MAPK和total p38 MAPK蛋白表達(dá)干預(yù)24小時(shí)后，提取細(xì)胞的蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1小時(shí)，分別加入鼠抗人phospho-p38 MAPK抗體(1∶ 1200)、鼠抗人p38 MAPK抗體(1∶1200)、鼠抗人caspase-3抗體 (1∶1000)和鼠抗人β-actin 抗體(1∶1500)，4 °C孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。使用caspase-3/β-actin和phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK顯影強(qiáng)度比值進(jìn)行蛋白表達(dá)量分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MTT法細(xì)胞活性檢測使用MTT法對對不同時(shí)間點(diǎn)(0h, 24h和48h)的人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞活性進(jìn)行測定。與對照組相比較，給予牛蒡苷干預(yù)的細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性均有降低，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；且各時(shí)間點(diǎn)ATG組細(xì)胞活性較ATG+SB組下降更加顯著，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，見表1。

表1　MTT比色法測定Tca8113細(xì)胞活性

注：①與Control組相比較P<0.05；②與ATG組相比較P<0.05

2.2p38 MAPK活性水平分析在干預(yù)24h后，使用western blot法對人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞p38 MAPK活化水平(phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK)進(jìn)行分析。與對照組相比，給予牛蒡苷干預(yù)后Tca8113細(xì)胞phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且ATG組phospho-p38 MAPK/total p38 MAPK比值升高水平較ATG+SB組更加明顯，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1和表2。

圖1Tca8113細(xì)胞p38 MAPK活化的western blot結(jié)果

Figure 1Western blot result of the activation of p38 MAPK in Tca8113 cells

Table 2　The activation of p38 MAPK and caspase-3 in Tca8113 cells

注：①與Control組相比較P<0.05；②與ATG組相比較P<0.05

2.3caspase-3活性水平分析在干預(yù)24h后，使用western blot法對人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞caspase-3活化水平(caspase-3/β-actin)進(jìn)行分析。與對照組相比，給予牛蒡苷干預(yù)后Tca8113細(xì)胞caspase-3/β-actin比值明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且ATG組caspase-3/β-actin比值升高水平較ATG+SB組更加明顯，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2和表2。

圖2Tca8113細(xì)胞p38 MAPK活化western blot結(jié)果

Figure 2The western blot result of the activation of p38 MAPK in Tca8113 cells

3討論

臨床研究和流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)在全球范圍內(nèi)舌癌在口腔癌中發(fā)病率最高。由于社會老齡化和飲食結(jié)構(gòu)改變等原因，舌癌的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，且有年輕化發(fā)展的傾向[1-3,14,15]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)舌癌的病理類型中鱗狀細(xì)胞癌多于腺癌，且多發(fā)生于舌前部，男性發(fā)病率高于女性[1-3,14,15]。一般舌癌的惡性程度較高，易在早期出現(xiàn)較大范圍浸潤和轉(zhuǎn)移[1-3,14,15]。由于舌器官的特殊性，治療較為困難，外科治療具有致殘性，導(dǎo)致部分甚至全舌缺如，味覺喪失，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。因此，發(fā)掘新的治療舌癌的藥物和方式具有較高的臨床價(jià)值和意義。

牛蒡苷(Arctigenin, ATG)是中草藥牛蒡子最重要的藥理成分，目前發(fā)現(xiàn)具有包括抑制炎癥反應(yīng)、解熱鎮(zhèn)痛、調(diào)控糖代謝、抑制氧化應(yīng)激和神經(jīng)元保護(hù)等多種生物活性[8-12]。同時(shí)近來多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)牛蒡苷還具有抗腫瘤的藥理作用[8-12]。Yang S等人的研究證實(shí)牛蒡苷可以促進(jìn)膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡[16]。Wang HQ等人發(fā)現(xiàn)牛蒡苷可以誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞對于順鉑的敏感性[9]。Hsieh CJ等人研究表明牛蒡苷可以促進(jìn)雌激素受體(ER)陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。本實(shí)驗(yàn)中我們使用牛蒡苷和p38 MAPK抑制劑SB203580對人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，在ATG干預(yù)后Tca8113細(xì)胞活性相對于對照組呈時(shí)間依賴性下降，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；但與ATG+SB組相比較，ATG組下降更加明顯，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。該結(jié)果表明牛蒡苷對于舌癌Tca8113細(xì)胞的增殖有抑制作用。

p38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的關(guān)鍵分子，大量研究證實(shí)p38 MAPK活化水平對于包括肺癌、結(jié)腸癌和宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、血管生成和腫瘤凋亡有重要的調(diào)控作用，促進(jìn)p38 MAPK的活化水平對多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用[4-7]。Liu J等人發(fā)現(xiàn)激活p38 MAPK可以有效的誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡[17]。Hui K等的研究證實(shí)p38 MAPK對結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞的凋亡均有調(diào)節(jié)作用[18]。同時(shí)近來多篇文獻(xiàn)報(bào)道牛蒡苷的生物活性和藥理作用與p38 MAPK信號通路的活化密切相關(guān)[12, 16]。首先本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)牛蒡苷對于Tca8113細(xì)胞活性的抑制作用可以被p38 MAPK抑制劑SB203580所拮抗(表1)。進(jìn)一步對舌癌Tca8113細(xì)胞p38 MAPK活化水平使用western blot分析后發(fā)現(xiàn)，ATG干預(yù)24小時(shí)后p38 MAPK磷酸化水平顯著增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且該作用亦可被p38 MAPK抑制劑SB203580所拮抗。該結(jié)果表明牛蒡苷對于Tca8113細(xì)胞增殖的抑制作用與促進(jìn)p38 MAPK活化密切相關(guān)。caspase-3是腫瘤凋亡調(diào)節(jié)的關(guān)鍵蛋白，大量研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)caspase-3活化水平可以誘導(dǎo)多種腫瘤的凋亡caspase-3也是p38 MAPK主要的下游分子之一[19, 20]。我們對caspase-3活化水平進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，ATG干預(yù)24小時(shí)后caspase-3活化水平明顯增加，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但該作用可被p38 MAPK抑制劑SB203580拮抗。該結(jié)果表明在舌癌Tca8113細(xì)胞中，牛蒡苷可通過p38 MAPK調(diào)節(jié)caspase-3活化的。

4結(jié)論

牛蒡苷可以通過激活p38 MAPK促進(jìn)caspase-3的活化，從而抑制人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞的增殖。該實(shí)驗(yàn)為牛蒡苷應(yīng)用于舌癌和其他腫瘤的臨床治療奠定了一定的基礎(chǔ)。

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