·論著·

擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)快速檢測(cè)H型高血壓患者M(jìn)THFR C677T基因型的應(yīng)用研究

王佳，王淑玲，周文勝，洪秀琴

作者單位：410016湖南省長(zhǎng)沙市，湖南省老年醫(yī)院 湖南省老年醫(yī)學(xué)研究所(王佳，王淑玲，周文勝，洪秀琴)；中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(王佳)，公共衛(wèi)生學(xué)院(洪秀琴)

通信作者：周文勝，410016湖南省長(zhǎng)沙市，湖南省老年醫(yī)院 湖南省老年醫(yī)學(xué)研究所；E-mail：zhouwensheng@163.com

洪秀琴，410000湖南省長(zhǎng)沙市，湖南省老年醫(yī)院 湖南省老年醫(yī)學(xué)研究所,中南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院；E-mail：hldhld@126.com

【摘要】目的 通過擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)-聚合酶鏈反應(yīng)(ARMS-PCR)檢測(cè)H型高血壓患者5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)C677T基因型，以期建立一種低成本、簡(jiǎn)單快速的MTHFR C677T基因分型方法。方法基于湖南省H型高血壓危險(xiǎn)因素研究的大型流行病調(diào)查的人群基礎(chǔ)，采用單純隨機(jī)方法，選取94例H型高血壓患者作為研究對(duì)象。設(shè)計(jì)阻滯度遞減的系列錯(cuò)配引物，采用ARMS-PCR對(duì)94例患者外周血樣本的MTHFR C677T基因型進(jìn)行鑒定，并抽取不同基因型進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。結(jié)果ARMS-PCR產(chǎn)物電泳后條帶清晰，易于判讀MTHFR C677T基因型。94例H型高血壓患者共檢出CC基因型42例、CT基因型24例和TT基因型28例。ARMS-PCR與DNA測(cè)序結(jié)果一致。結(jié)論ARMS-PCR經(jīng)阻滯度遞減的系列錯(cuò)配引物能有效對(duì)MTHFR C677T基因型進(jìn)行鑒定，此法具有成本低、操作簡(jiǎn)單、用時(shí)短的優(yōu)點(diǎn)。適用于各類基因的多態(tài)性分析。

【關(guān)鍵詞】擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)；5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶；基因分型；H型高血壓

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81202281)；湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014FJ3035)

【中圖分類號(hào)】R 544.1R-33

收稿日期：(2015-08-28；修回日期：2015-10-18)

王佳，王淑玲，周文勝，等.擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)快速檢測(cè)H型高血壓患者M(jìn)THFR C677T基因型的應(yīng)用研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2015，18(35)：4303-4306.[www.chinagp.net]

Rapid Detection of MTHFR C677T Genotype in H-type Hypertension Patients by Amplification Refractory Mutation SystemWANGJia，WANGShu-ling，ZHOUWen-sheng，etal.HunanInstituteofGerontology，HunanGeriatricHospital，Changsha410016，China

Abstract【】ObjectiveTo develop a cost-effective，rapid and simple method for MTHFR C677T genotyping by amplification refractory mutation system-polymerase chain reaction(ARMS-PCR)on H-type hypertension patients.MethodsFrom the population sampled by the large epidemiological investigation based on the research of risk factors for H-type hypertension in Hunan Province，94 H-type hypertension patients were taken as subjects using simple random method.A series of mismatched-primers of refractory reduced were designed，and ARMS-PCR was employed to identify the MTHFR C677T genotypes of peripheral blood samples of the 94 patients，and different genotypes were abstracted for sequencing validation.ResultsThe bands of ARMS-PCR product agarose gel electrophoretogram were clear sufficiently to identify genotype.Among the 94 H-type hypertension patients 42 were CC genotype，24 were CT genotype and 28 were TT genotype.ARMS-PCR results were in complete accord with DNA sequencing.ConclusionARMS-PCR is a low-cost，simple and time-saving method for the determination of MTHFR C677T genotype by mismatched-primers of refractory reduced.The approach can be used to detect other gene polymorphism.

【Key words】Amplification refractory mutation system；5，10-methylenetetrahydrofolate reductase；Genotyping；H-type hypertension

伴有高血漿同型半胱氨酸(Hcy)血癥(一般指Hcy≥15 μmol/L)的高血壓，稱為H型高血壓[1]。有數(shù)據(jù)顯示，目前我國30歲及以上人群中有3.3億為高血壓患者，而其中75%伴有血漿Hcy水平升高。越來越多的研究表明，高血漿Hcy血癥和高血壓在導(dǎo)致心腦血管事件上存在協(xié)同作用，Hcy增高合并高血壓的心腦血管風(fēng)險(xiǎn)升高10.3倍[2-3]。遺傳和環(huán)境是影響Hcy水平的最主要因素。其中5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是Hcy代謝過程中的關(guān)鍵代謝酶，該酶基因易發(fā)生667C→T突變，導(dǎo)致酶的活性降低，Hcy代謝異常，進(jìn)而引起高血漿Hcy血癥。因此，進(jìn)行MTHFR C677T基因的多態(tài)性檢測(cè)，預(yù)測(cè)H型高血壓患病的易感人群，對(duì)預(yù)防H型高血壓的發(fā)生具有重有意義。故而一種快速而簡(jiǎn)便的MTHFR C677T基因分型法對(duì)任何一個(gè)參與H型高血壓臨床研究的實(shí)驗(yàn)室而言都是必需的。本研究旨在探討擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)檢測(cè)H型高血壓患者M(jìn)THFR C677T基因型的準(zhǔn)確性。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象基于湖南省H型高血壓危險(xiǎn)因素研究的大型流行病調(diào)查的人群基礎(chǔ)[4]，采用單純隨機(jī)方法，選取94例H型高血壓患者作為研究對(duì)象。

1.2主要儀器和試劑聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增儀為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；電泳儀為天能公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光成像儀為美國GE公司ImageQuant LAS 500；核酸蛋白定量檢測(cè)儀為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品；血液基因組DNA小量抽提試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物有限公司；Takara Taq DNA聚合酶購自寶生物工程(大連)有限公司；ARMS-PCR引物由北京六合華大基因公司合成。

從靜態(tài)看盤去分析個(gè)股有沒機(jī)構(gòu)活動(dòng)？或有沒新資金進(jìn)怎么看。1、看多日K線看量能變化；2、看分時(shí)走勢(shì)表現(xiàn)；3、看盤中成交明細(xì)；4、多日分時(shí)走勢(shì)連貫分析。

1.3方法

1.3.1人外周血白細(xì)胞提取DNA采集3～5 ml清晨空腹外周靜脈血，取EDTA抗凝血300 μl，使用北京天根生化血液基因組DNA小量抽提試劑盒法提取DNA，具體步驟按說明書進(jìn)行操作，其中離心過程均采用水平離心機(jī)，以10 000 r/min離心1 min，離心半徑8 cm。使用BIO-RAD核酸蛋白定量檢測(cè)儀測(cè)定所提取DNA在260 nm和280 nm處的吸光度，計(jì)算其純度和濃度，以滅菌蒸餾水調(diào)整終濃度為20 mg/L。樣本分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2引物設(shè)計(jì)MTHFR C677T是一種不規(guī)范的HGVS Names標(biāo)注SNP位置，GenBank對(duì)MTHFR C667T的refSNP ID為rs1801133。本研究在NCBI的SNP數(shù)據(jù)庫中查找rs1801133的參考核酸序列號(hào)NG_013351，據(jù)此序列設(shè)計(jì)了MTHFR C677T的阻滯度遞減的系列錯(cuò)配引物(見表1)，其中上游引物3′端固定地終止于MTHFR C677T的突變位點(diǎn)，并且為了提高引物的特異性，在上游引物3′端倒數(shù)第3、4位引入錯(cuò)配堿基。

1.3.3采用ARMS-PCR方法對(duì)MTHFR C677T進(jìn)行基因分型首先以錯(cuò)配后阻滯度最高因而擴(kuò)增差異性最顯著的F11/R和F12/R引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)基因組DNA樣品平行建立C、T兩個(gè)反應(yīng)體系：C反應(yīng)中加入F11/R引物對(duì)，T反應(yīng)中加入F12/R引物對(duì)。通過引物退火溫度、模板濃度和反應(yīng)循環(huán)數(shù)對(duì)PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5 μl，dNTP Mixture(各2.5 mmol/L)2 μl，Takara Taq(5 U/μl)0.125 μl，F(xiàn)11/R和F12/R(10 μmol/L)0.625 μl，R(10 μmol/L)0.625 μl，模板DNA(20 ng/μl)2.5 μl，ddH2O 16.625 μl，共25 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 30 s，53.8 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，最后72 ℃保溫5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，采用美國GE化學(xué)發(fā)光成像儀攝片。實(shí)驗(yàn)過程中，對(duì)電泳檢測(cè)表現(xiàn)為雙泳道陰性結(jié)果的樣本，依次換用阻滯度下降的引物對(duì)(F21/R和F22/R、F31/R和F32/R)再行擴(kuò)增。

表1阻滯度遞減的MTHFR C677T等位基因分型ARMS-PCR系列引物

Table 1A series of ARMS-PCR mismatched-primers of refractory reduced for MTHFR C677T genotyping

引物名稱引物序列F11(等位基因特異性上游引物1)5'-AGAAGGTGTCTGCGGttGC-3'F12(等位基因特異性上游引物2)5'-AGAAGGTGTCTGCGGttGT-3'F21(等位基因特異性上游引物1)5'-AGAAGGTGTCTGCGGGtGC-3'F22(等位基因特異性上游引物2)5'-AGAAGGTGTCTGCGGGtGT-3'F31(等位基因特異性上游引物1)5'-AGAAGGTGTCTGCGGtAGC-3'F32(等位基因特異性上游引物2)5'-AGAAGGTGTCTGCGGtAGT-3'R(等位基因特異性共用下游引物)5'-GAAACACTGATTTAAGCAGGATTTG-3'

注：下劃線所示堿基為SNP位點(diǎn)堿基，C為野生型，T為突變型；小寫字母表示引入的錯(cuò)配堿基及位置

1.3.4PCR產(chǎn)物基因測(cè)序單純隨機(jī)選取不同基因型的PCR產(chǎn)物(各15例)，送至北京六合華大基因公司測(cè)序分析，驗(yàn)證電泳結(jié)果。

2結(jié)果

2.1MTHFR C677T的ARMS-PCR基因分型結(jié)果分型標(biāo)準(zhǔn)：C反應(yīng)體系是對(duì)MTHFR C677T基因C等位基因的擴(kuò)增，T反應(yīng)體系是對(duì)MTHFR C677T基因T等位基因的擴(kuò)增。在兩個(gè)反應(yīng)體系中如果只有C反應(yīng)體系擴(kuò)增到425 bp產(chǎn)物，即為MTHFR C677T基因野生CC型；若兩個(gè)反應(yīng)體系均擴(kuò)增到425 bp產(chǎn)物，即為MTHFR C677T基因雜合突變CT型；若只有T反應(yīng)體系擴(kuò)增到425 bp產(chǎn)物，即為MTHFR C677T基因純合突變TT型。

首先以錯(cuò)配后阻滯度最高因而擴(kuò)增差異性最顯著的F11/R和F12/R(見圖1A)引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，然后對(duì)電泳檢測(cè)表現(xiàn)為雙泳道陰性結(jié)果的標(biāo)本，依次換用阻滯度下降的引物對(duì)F21/R和F22/R(見圖1B)、F31/R和F32/R(見圖1C)再行擴(kuò)增。據(jù)此檢測(cè)方法，94例H型高血壓患者共檢出野生CC基因型42例，雜合突變CT基因型24例和純合突變TT基因型28例。

2.2PCR產(chǎn)物堿基序列測(cè)序結(jié)果隨機(jī)選取不同基因型的PCR產(chǎn)物(各15例)經(jīng)基因測(cè)序分析顯示均與ARMS-PCR分型結(jié)果相一致(見圖2)。

注：M=DL2 000 DNA Marker；A=F11/R和F12/R擴(kuò)增結(jié)果；B=F21/R和F22/R擴(kuò)增結(jié)果；C=F31/R和F32/R擴(kuò)增結(jié)果；1、4、5和7=野生CC基因型；3=雜合突變CT基因型；2和6=純合突變TT基因型

圖1ARMS-PCR方法檢測(cè)MTHFR C677T基因多態(tài)性分型電泳圖

Figure 1Electrophoretogram of MTHFR C677T genotyping by ARMS-PCR

注： ↑所示突變位點(diǎn)；A=野生CC基因型，B=雜合突變CT基因型，C=純合突變TT基因型

圖2PCR產(chǎn)物堿基測(cè)序圖

Figure 2Sequencing of the PCR products base

3討論

DNA測(cè)序顯然是MTHFR C677T基因分型最準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，但一般也需先對(duì)樣本行普通PCR后再送去生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，如果樣本量大，成本則比較高。臨床與基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室受設(shè)備的限制，大多采用聚合酶式反應(yīng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法進(jìn)行MTHFR C677T基因多態(tài)性測(cè)定，該方法需經(jīng)歷PCR擴(kuò)增、HinfI限制性內(nèi)切酶消化、瓊脂糖電泳等步驟。耗時(shí)、成本高、操作復(fù)雜，還有可能存在酶切不充分等現(xiàn)象。

ARMS-PCR又稱等位基因特異性擴(kuò)增，是以Taq DNA聚合酶缺少3′-5′外切酶活性，不能修復(fù)擴(kuò)增時(shí)引物3′末端單個(gè)堿基的錯(cuò)配為基礎(chǔ)，引物的3′端堿基與位點(diǎn)等位基因互補(bǔ)時(shí)，則繼續(xù)擴(kuò)增；當(dāng)引物3′端堿基與位點(diǎn)等位基因錯(cuò)配時(shí)，則擴(kuò)增停止或者是效率嚴(yán)重下降。ARMS-PCR與PCR-RFLP的分型方法相比，因不需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切消化，減少了限制性內(nèi)切酶的使用以及實(shí)驗(yàn)操作環(huán)節(jié)，因此，明顯節(jié)約了時(shí)間(一般只需3 h)，降低了成本，提高了效率。

引物設(shè)計(jì)是ARMS-PCR反應(yīng)中最主要環(huán)節(jié)。為了增加擴(kuò)增特異性，提高檢測(cè)精準(zhǔn)性，本研究通過在MTHFR C677T上游引物3′末端的第3、4位堿基位點(diǎn)上引入錯(cuò)配堿基，設(shè)計(jì)了F11/R和F12/R、F21/R和F22/R、F31/R和F32/R退火難度(阻滯度)遞減的系列錯(cuò)配引物，從而可不斷糾正涉及引物結(jié)合范圍內(nèi)的模板DNA差異導(dǎo)致的引物退火難度的增加。有研究同樣證實(shí)在特異引物第4位堿基處引入錯(cuò)配在某些條件下比在第2位或第3位引入錯(cuò)配的特異性強(qiáng)，并且發(fā)現(xiàn)對(duì)于個(gè)別引物而言，在第3位和第4位同時(shí)引入2個(gè)錯(cuò)配堿基比僅在第 2位或第3位引入錯(cuò)配的特異性強(qiáng)[5-6]。本實(shí)驗(yàn)過程中，首先用錯(cuò)配后阻滯度最高因而擴(kuò)增差異性最顯著的F11和F12引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，然后用對(duì)電泳檢測(cè)表現(xiàn)為雙泳道陰性結(jié)果的標(biāo)本，依次換用阻滯度下降的引物對(duì)再行擴(kuò)增，這些標(biāo)本也逐次獲得了理想的分型結(jié)果。

許多研究表明[7-8]，MTHFR C677T純合突變TT基因型攜帶者患H型高血壓風(fēng)險(xiǎn)升高。所以，對(duì)人群進(jìn)行MTHFR C677T基因的多態(tài)性快速檢測(cè)，預(yù)測(cè)H型高血壓患病的易患人群，對(duì)預(yù)防H型高血壓的發(fā)生具有重要意義。理論上，只要設(shè)計(jì)好ARMS-PCR阻滯度遞減的系列錯(cuò)配引物，ARMS-PCR適用于各類基因的多態(tài)性分析。

本文價(jià)值：

本研究通過設(shè)計(jì)阻滯度遞減的系列錯(cuò)配引物，采用ARMS-PCR對(duì)H型高血壓患者外周血樣本的MTHFR C677T基因型進(jìn)行鑒定。大量研究表明，MTHFR C677T基因中TT基因型突變對(duì)H型高血壓的高發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有顯著貢獻(xiàn)，因此，建立一種快速而低成本的檢測(cè)MTHFR C677T基因型的分型方法對(duì)任何一個(gè)參與H型高血壓臨床研究的實(shí)驗(yàn)室而言都是必需的，并且該法簡(jiǎn)便易行，可操作性強(qiáng)，對(duì)臨床可能有較大的幫助。

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(本文編輯：賈萌萌)