·論著·

奧沙利鉑長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的制備及其在小鼠體內(nèi)的藥效學(xué)研究

李哲，馬海英*(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院藥學(xué)部，沈陽(yáng) 110032)

[摘要]目的：制備奧沙利鉑長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，考察其在小鼠體內(nèi)的藥效學(xué)。方法：采用乙醇注入法制備奧沙利鉑長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，觀察其形態(tài)，測(cè)定粒徑分布和包封率。以S180荷瘤小鼠為模型，生理鹽水為對(duì)照，測(cè)定奧沙利鉑溶液和奧沙利鉑長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的抑瘤率，考察腫瘤生長(zhǎng)情況以及小鼠生存情況。分別測(cè)定小鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，以考察對(duì)免疫器官的影響。結(jié)果：奧沙利鉑長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體平均粒徑為(112.2±0.3) nm，包封率為(59.93±0.67)%(n=3)。與奧沙利鉑溶液相比，奧沙利鉑長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的抑瘤率明顯提高[(30.4±1.9)% vs (85.8±2.3)%，P<0.05]。奧沙利鉑脂質(zhì)體組小鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)與生理鹽水組相比，無(wú)顯著性差異(P>0.05)，腫瘤體積增長(zhǎng)緩慢，小鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好。結(jié)論：奧沙利鉑長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體有顯著的抑瘤作用，并減少了奧沙利鉑的免疫系統(tǒng)毒性。

[關(guān)鍵詞]奧沙利鉑；長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體；藥效學(xué)；小鼠

[中圖分類號(hào)]R979.1,R944.9[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI：10.5428/pcar20150109

基金項(xiàng)目遼寧省科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(2011225020)

作者簡(jiǎn)介李哲(女)，碩士，藥師.

[收稿日期]2014-01-16

Preparation of oxaliplatin long circulating liposomes and their pharmacodynamics in mice

LI Zhe，MA HaiYing*(Department of Pharmacy，the Fourth Hospital Affiliated to China Medical University，Shenyang 110032，China)

ABSTRACT[]Objective:To prepare oxaliplatin long circulating liposomes and study their pharmacodynamics in mice.Methods:The oxaliplatin long circulating liposomes were prepared by ethanol injection and morphology was observed,the grain size and entrapment efficiency were determined.Tumor inhibition rates,tumor growth situation，survival situation of mice administered with oxaliplatin solution and long circulating liposomes were investigated with S180 tumor-bearing mouse as animal models and physiological saline as control.The count of white blood cells,spleen index and thymus index in mice were determined to evaluate the toxicity of oxaliplatin to immune organs.Results: The average grain size of oxaliplatin long circulating liposomes were (112.2±0.3) nm，and the entrapment efficiency was (59.93±0.67)%(n=3).Compared with oxaliplatin solution,tumor inhibition rate of oxaliplatin long circulating liposomes was obviously increased [(30.4±1.9)% vs(85.8±2.3)%，P<0.05].There were no significant differences in the count of white blood cells, spleen index and thymus index, as compared with those of the physiological saline group (P>0.05). Tumor volume in the mice administered with oxaliplatin long circulating liposomes increased rather slowly, and the mice all survived. Conclusion: Oxaliplatin long circulating liposomes seemed to have significant inhibitory effects on tumors and could reduce oxaliplatin toxicity to the immune system.

[KEY WORDS]oxaliplatin; long circulating liposome; pharmacodynamics; mice

[Pharm Care Res，2015，15(1): 27-30]

E-mail: lizhe19850301@126.com

*通信作者(Corresponding author)：馬海英，E-mail：cmu4h-mhy@126.com

奧沙利鉑是第三代鉑類抗腫瘤藥物，常用于治療結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌和乳腺癌等多種癌癥，對(duì)順鉑和卡鉑耐藥腫瘤也有顯著抑制作用。該藥具有骨髓、心臟、周圍神經(jīng)毒性，可能導(dǎo)致白細(xì)胞減少、胃腸功能紊亂、過(guò)敏等藥物不良反應(yīng)，其普通劑型還存在不穩(wěn)定的問(wèn)題。脂質(zhì)體作為藥物載體具有增強(qiáng)藥物靶向性和治療效果，減少毒副作用等優(yōu)點(diǎn)[1]。聚乙二醇(PEG)修飾的長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體能增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性，降低清除率，延長(zhǎng)作用時(shí)間[2]。奧沙利鉑為細(xì)胞毒性藥物，有關(guān)奧沙利鉑脂質(zhì)體對(duì)免疫器官的影響國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究將奧沙利鉑制備成長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體，以白細(xì)胞計(jì)數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)為指標(biāo)，考察其對(duì)免疫器官的毒副作用，綜合評(píng)價(jià)其藥效學(xué)。

1材料

1.1儀器TN型托盤式扭力天平(上海第二天平儀器廠)；Nicomp-380激光粒度測(cè)定儀(美國(guó)PSS公司)；756MC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；TDL80-2B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；PHS-25型pH計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；DF-101S磁力攪拌器(鞏義市英峪予華儀器廠)；CP214電子分析天平(美國(guó)奧豪斯公司)；IX51奧林巴斯倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；DAD二極管陣列檢測(cè)器(大連依利特科學(xué)儀器有限公司)；Diamonsil C18色譜柱(美國(guó)迪馬公司)。

1.2藥品和試劑奧沙利鉑原料藥(純度≥99.0%，齊魯制藥有限公司)；葡聚糖凝膠G-50(英國(guó)Amersham Biosciences公司) ；氫化大豆卵磷脂(HSPC，德國(guó) Lucas Meyer公司)；膽固醇(Chol，南京新百藥業(yè)有限公司)；聚乙二醇單甲醚2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE，美國(guó) Genzyme 公司)；無(wú)水乙醇(藥用級(jí)，安徽安特生物化學(xué)有限公司)；0.9%氯化鈉注射液(生理鹽水，沈陽(yáng)志鷹制藥廠)；滅菌注射用水(沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院自制)；肝素(12 500 U/支，上海第一生化藥業(yè)有限公司)；重蒸水(沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥業(yè)有限責(zé)任公司)；其他試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和瘤株42只雄性昆明種小鼠，重量18～22 g[沈陽(yáng)藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(遼2013-0005)]。S180小鼠腫瘤細(xì)胞株(遼寧省腫瘤研究所，批號(hào)20130622)。

2方法和結(jié)果

2.1脂質(zhì)體的制備采用乙醇注入法制備奧沙利鉑長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體(oxaliplatin long circulating liposomes,OLCL)。將HSPC、Chol和mPEG2000-DSPE按質(zhì)量比3∶1∶1混合，加入無(wú)水乙醇(使乙醇終濃度為10%)，于60 ℃水浴中攪拌溶解。在5 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.1，按《中華人民共和國(guó)藥典》2010 版二部附錄ⅩⅤD法配制)5 ml 中加入10 mg/ml奧沙利鉑水溶液5 ml，混合得到奧沙利鉑磷酸鹽溶液，將其預(yù)熱至60 ℃，加入磷脂混合物中水化。在水浴中孵育15 min后，冷卻至室溫，在細(xì)胞破碎儀的探頭下超聲分散(200 w×2 min+400 w×6 min，工作10 s，間歇10 s)，最后經(jīng)0.80、0.45、0.22 μm微孔濾膜依次濾過(guò)整粒，得到含奧沙利鉑濃度為5 mg/ml的OLCL。

圖1　奧沙利鉑長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體的透射電鏡圖(×10 5) Figure 1　The transmission electron microscope photographs of oxaliplatin long circulating liposomes(×10 5)

2.2脂質(zhì)體的形態(tài)和粒徑分布采用磷鎢酸負(fù)染法制備透射電鏡樣品。將OLCL用蒸餾水稀釋至10倍體積后，取適量滴于銅網(wǎng)上，浸泡于2%磷鎢酸溶液(用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.0)中染色2～5 min。用烘箱烘干銅網(wǎng)后，在透射電鏡下觀察OLCL的形態(tài)，見(jiàn)圖1。由圖1清晰可見(jiàn)，OLCL雙層結(jié)構(gòu)明顯，呈球形或橢球形，分散良好，未見(jiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象。取OLCL適量，用滅菌注射用水稀釋至光密度為250～350，將稀釋液放入樣品池內(nèi)，采用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定OLCL粒徑。測(cè)定條件：光源為He-Ne 激光(空氣冷卻)，波長(zhǎng)632.8 nm，功率75 mw，溫度23 ℃，測(cè)得3批脂質(zhì)體的粒徑為(112.2±0.3) nm(n=3)。

2.3包封率的測(cè)定(1)色譜條件色譜柱：Diamonsil C18色譜柱(200 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水(10∶90)；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流速：l ml/min；進(jìn)樣量：20 μl[3]。(2)檢測(cè)方法采用葡聚糖凝膠微柱離心法，將葡聚糖凝膠Sephadex G-50在重蒸水中浸泡過(guò)夜，充分溶脹后，裝于2.5 ml注射器內(nèi)，凝膠柱柱高約為2.5 cm，使水分自然流下。將裝有葡聚糖凝膠的注射器以223.6×g離心4 min(以下同)，除去水分。精密吸取0.1 ml OLCL置凝膠柱頂端，離心，加100 μl蒸餾水置凝膠柱頂端，離心，連續(xù)操作兩次。收集管內(nèi)液體，轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶?jī)?nèi)，加入1 ml 10%的Triton X-100水溶液，用蒸餾水定容。按上述色譜條件測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法計(jì)算上清液中奧沙利鉑的濃度，即為游離藥物濃度(ρ游離)。另取0.1 ml OLCL置5 ml量瓶中，加入1 ml 10%的Triton X-100水溶液，用蒸餾水定容，進(jìn)樣測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算藥物總濃度(ρ總)[4]。包封率=[ (ρ總-ρ游離)/ρ總]×100%。計(jì)算得到3批脂質(zhì)體的包封率為(59.93±0.67)%(n=3)。

2.4藥效學(xué)研究

2.4.1S180瘤株的接種從液氮中取出S180腫瘤細(xì)胞凍存管，迅速置37 ℃溫水中復(fù)蘇。將復(fù)蘇的腫瘤細(xì)胞懸液接種于小鼠腹腔內(nèi)(0.2 ml/只)，7 d后在無(wú)菌條件下抽取乳白色黏稠腹水， 在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，腫瘤細(xì)胞活度>95%。加生理鹽水稀釋成腫瘤細(xì)胞混懸液，使瘤細(xì)胞數(shù)為1.8×107個(gè)/ml。將腫瘤細(xì)胞混懸液(0.1 ml/只)接種于昆明種小鼠左前腋下的皮下組織，共接種42只小鼠。

2.4.2白細(xì)胞計(jì)數(shù)、抑瘤率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的測(cè)定將21只接種S180腫瘤細(xì)胞混懸液的小鼠隨機(jī)分為3組：生理鹽水組、奧沙利鉑溶液組和OLCL組，每組7只。給藥劑量為10 mg/kg，分別于接種后第4、7、10天尾靜脈注射給藥，給藥后正常飼養(yǎng)。(1)白細(xì)胞計(jì)數(shù)：在接種S180腫瘤細(xì)胞懸液后d 13，于小鼠眼眶靜脈叢取血測(cè)定白細(xì)胞。每次取血20 μl置肝素抗凝的EP管中，加入0.38 ml稀釋液(即1.5%冰乙酸溶液，含1%龍膽紫)，快速振蕩30 s搖勻后，取10 μl滴至白細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，蓋上蓋玻片，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)。數(shù)四角大方格的白細(xì)胞總數(shù)，×50即為白細(xì)胞數(shù)(單位：個(gè)/mm3)，再×106轉(zhuǎn)換成白細(xì)胞計(jì)數(shù)(單位：×109/L)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，與生理鹽水組相比，奧沙利鉑溶液組的白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低(P<0.05)，而OLCL組基本無(wú)變化(P>0.05)。(2)抑瘤率：將小鼠斷頸處死，完整剝離皮下腫瘤，稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=[ (wNS-wOXA)/wNS]×100%，式中wNS指生理鹽水組平均瘤重，wOXA指給藥組平均瘤重。采用獨(dú)立t檢驗(yàn)法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，OLCL組抑瘤率高，與奧沙利鉑溶液組相比，存在顯著性差異(P<0.05)。(3)脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)：將小鼠處死后，分別剝離脾臟和胸腺，稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)=(脾臟重量/小鼠體重)(mg/g)，胸腺指數(shù)=(胸腺重量/小鼠體重)(mg/g)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，與生理鹽水組相比，奧沙利鉑溶液組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯降低(P<0.05)，而OLCL組基本無(wú)變化(P>0.05)，表明OLCL對(duì)脾臟和胸腺的影響明顯小于奧沙利鉑溶液。

2.4.3腫瘤生長(zhǎng)情況另21只小鼠接種S180腫瘤

表1抑瘤率、S180荷瘤小鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、

脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)

Table 1The tumor inhibition rates，count of white

blood cells，spleen index and thymus index of

S180-bearing mice

*P<0.05,與生理鹽水組比較；△P<0.05，與奧沙利鉑溶液組比較

細(xì)胞懸液后同2.4.2項(xiàng)法分組及給藥。d 4～16每天測(cè)定小鼠體重及腫瘤體積，之后每隔一天測(cè)定一次，直到d 30，并觀察小鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)。各組小鼠的腫瘤體積變化見(jiàn)圖2(A)，體重變化見(jiàn)圖2(B)。由圖2可見(jiàn)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，腫瘤體積逐漸增大，小鼠體重均有增長(zhǎng)。與奧沙利鉑溶液組相比，OLCL組小鼠的腫瘤體積更小，而體重更重。從生存狀態(tài)來(lái)看，OLCL組小鼠較活躍，活動(dòng)狀態(tài)明顯優(yōu)于生理鹽水組和奧沙利鉑溶液組。表明OLCL對(duì)小鼠正常體重和生存狀態(tài)的影響比奧沙利鉑溶液更小，而腫瘤抑制作用更強(qiáng)。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)，與奧沙利鉑溶液組相比，OLCL顯著提高了奧沙利鉑的抑瘤率。分析原因可能是由于奧沙利鉑毒副作用較多，在抑制腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)正常組織、細(xì)胞也有損傷，造成機(jī)體功能下降；而脂質(zhì)體可以提高藥物的治療指數(shù)并降低藥物毒副作用。將PEG加入到脂質(zhì)體膜材中，制備長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體， 進(jìn)一步延長(zhǎng)了脂質(zhì)體的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間，降低了奧沙利鉑的毒副作用，提高了藥物的治療效果[5，6]。奧沙利鉑是一種細(xì)胞毒性藥物，常見(jiàn)不良反應(yīng)包括引起中性粒細(xì)胞和白細(xì)胞減少。本研究發(fā)現(xiàn)，奧沙利鉑溶液組小鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著低于生理鹽水組，而OLCL組小鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)與生理鹽水組無(wú)顯著性差異，這表明長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體減少了奧沙利鉑對(duì)白細(xì)胞的殺傷作用。本研究采用脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)機(jī)體免疫水平，由于實(shí)驗(yàn)后期各組小鼠體重存在一定差異，因此要比較臟器相對(duì)重量來(lái)進(jìn)行免疫評(píng)價(jià)。脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)比較結(jié)果反映OLCL對(duì)免疫系統(tǒng)的副作用小，并未明顯抑制小鼠的免疫器官功能，降低了對(duì)正常組織、細(xì)胞的損傷[7]。

圖2　小鼠腫瘤體積和體重隨時(shí)間的變化曲線 Figure 2　The changing curves of tumor volume and body weight in mice A：腫瘤體積；B：小鼠體重； ○：生理鹽水組； ●：奧沙利鉑溶液組； △：奧沙利鉑長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體組；n=7， ±s

【參考文獻(xiàn)】

[1]倪睿，劉建平.脂質(zhì)體作為抗腫瘤藥物載體的應(yīng)用研究[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2008，8(2)：89-92.

Ni Rui,Liu JianPing.Applied study of liposomes as carriers of anti-cancer drugs[J].Pharm Care Res, 2008，8(2)：89-92.In Chinese with English abstract.

[2]張小洪,王建華.修飾性脂質(zhì)體材料及其藥學(xué)應(yīng)用研究[J].化工新型材料,2013,41(5):153-155.

Zhang XiaoHong,Wang JianHua.Material of modified liposome and its applied research in pharmacy[J].New Chem Mater,2013,41(5): 153-155. In Chinese with English abstract.

[3]趙靜，趙華，蔣心惠.HPLC法測(cè)定奧沙利鉑脂質(zhì)體中奧沙利鉑的含量[J].中國(guó)藥房,2010，21(32):3058-3060.

Zhao Jing，Zhao Hua，Jiang XinHui.Content determination of oxaliplatin in oxaliplatin liposome by HPLC[J].China Pharmacy,2010，21(32):3058-3060.In Chinese with English abstract.

[4]劉陽(yáng)，郭偉英.Box-Behnken 設(shè)計(jì)法優(yōu)化奧沙利鉑脂質(zhì)體的處方工藝[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2013,30(11):1196-1202.

Liu Yang,Guo WeiYing.Optimization of oxaliplatin liposome formulation by Box-Behnken experimental design[J].Chin J Mod Appl Pharm,2013,30(11):1196-1202.In Chinese with English abstract.

[5]徐洋,石莉,鄧意輝.聚乙二醇-脂質(zhì)衍生物修飾對(duì)脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2011,46 (10):1178-1186.

Xu Yang,Shi Li,Deng YiHui.Effect of polyethylene glycol-lipid derivatives on the stability of grafted liposomes[J].Acta Pharm Sin,2011,46 (10):1178-1186.In Chinese with English abstract.

[6]時(shí)念秋,馬毅,張大同,等.長(zhǎng)循環(huán)脂質(zhì)體在抗腫瘤藥物中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志,2008,17(3):190-194.

Shi NianQiu,Ma Yi,Zhang DaTong,etal.The progress in the application of long circulation liposomes drugs in anti-tumour therapy[J].Chin J New Drugs, 2008,17(3):190-194.In Chinese with English abstract.

[7]Zalba S,Navarro I,Trocóniz I F,etal.Application of different methods to formulate PEG-liposomes of oxaliplatin:evaluationinvitroandinvivo[J].Eur J Pharm Biopharm,2012,81(2):273-280.

[修回日期]2014-07-26

[本文編輯]蘭芬