■劉美思 王秀武 許青松 程立坤 尹 恒

(1.中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所天然產(chǎn)物及糖工程試驗(yàn)室，遼寧大連 116011；2.遼寧師范大學(xué)，遼寧大連 116021；3.大連海洋大學(xué)，遼寧大連 116023)

仔豬的免疫能力是養(yǎng)殖者十分關(guān)注的問(wèn)題。學(xué)者們通常對(duì)仔豬免疫器官[1]、血清[2]或腸道免疫系統(tǒng)[3-4]進(jìn)行考察，評(píng)價(jià)其免疫作用。許多仔豬會(huì)因免疫力低下而早夭，對(duì)飼養(yǎng)者的經(jīng)濟(jì)等造成巨大損失。因此，如何有效且健康地提升仔豬的免疫能力，成為畜牧業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)之一。功能性寡糖作為天然、健康的飼料添加劑在養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的使用日趨廣泛。有研究指出，飼料中添加4%的果寡糖可以用于提升斷奶仔豬的增重，改善腸道功能[5]。也有研究指出，飼料中添加寡糖，對(duì)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能[6]、免疫能力[7]、腸道菌群及消化[8-9]等均有良好的調(diào)節(jié)作用。Che等(2012)[10]通過(guò)豬的體內(nèi)和體外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，甘露寡糖可以作為免疫調(diào)節(jié)劑直接激活巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，也可以降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)，對(duì)宿主的防御和避免有害的過(guò)度刺激具有重要作用。

胸腺和脾臟是重要的免疫器官。脾臟中包含著眾多免疫細(xì)胞，而T細(xì)胞在胸腺中成熟。在考察動(dòng)物免疫力的高低時(shí)，胸腺、脾臟的質(zhì)量及指數(shù)經(jīng)常作為重要的參考指標(biāo)，然而對(duì)兩種免疫器官的酶活力的檢測(cè)卻并不常見(jiàn)。本文通過(guò)考察飼料中添加COS對(duì)仔豬胸腺、脾臟的相關(guān)免疫酶活力的影響，探究飼料中添加COS對(duì)仔豬免疫的影響，為COS作為飼料中添加的免疫增強(qiáng)劑的研究提供數(shù)據(jù)積累。

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用COS系本試驗(yàn)室自行制備（聚合度在2～8，脫乙酰度＞95%，平均分子量＜1 kDa）。免疫酶試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。RIPA蛋白裂解液購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織樣品的采集

本試驗(yàn)在四川省遂寧市高金生態(tài)牧業(yè)豬場(chǎng)進(jìn)行。飼養(yǎng)試驗(yàn)共計(jì)28 d。試驗(yàn)分為兩組，每組10頭仔豬，其中一組為對(duì)照組，一組為試驗(yàn)組（COS組）。仔豬斷奶后，對(duì)照組仔豬飼喂基礎(chǔ)仔豬日糧，試驗(yàn)組仔豬飼喂含COS（50 g/t）的試驗(yàn)日糧。仔豬飼喂28 d后，屠宰仔豬，取仔豬胸腺、脾臟的樣本，生理鹽水沖洗后置于滅菌的離心管中，快速存于液氮中。

1.2.2 免疫酶檢測(cè)

在空白對(duì)照組和COS組分別隨機(jī)抽取5個(gè)樣本，利用勻漿器和蛋白裂解液將其研磨成漿，低溫靜置30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清待用。

一氧化氮合酶（NOS）總活力、NOS分型活力及過(guò)氧化氫酶（CAT）活力測(cè)定根據(jù)南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 22.0軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進(jìn)行方差分析，所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，差異顯著時(shí)對(duì)平均值進(jìn)行Duncan's法多重比較。“*”表示P＜0.05，“**”表示P＜0.01。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 COS對(duì)仔豬胸腺、脾臟NOS活力的影響

飼料中添加COS對(duì)仔豬胸腺、脾臟相關(guān)氧化酶活力的影響均通過(guò)對(duì)組織裂解液的檢測(cè)來(lái)評(píng)估。試驗(yàn)結(jié)果如圖1，COS組的仔豬胸腺、脾臟的NOS活力較空白對(duì)照組分別提升了43.5%（P＜0.01）和5.3%。NOS可分為結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶（cNOS）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）兩種。NOS分型檢測(cè)結(jié)果如圖2、圖3、圖4，仔豬胸腺cNOS活力顯著提升了74.9%（P＜0.01）（見(jiàn)圖4），其余樣本相關(guān)NOS活力變化并不明顯。

圖1 COS對(duì)仔豬胸腺（a）、脾臟（b）NOS活力的影響

圖2 COS對(duì)仔豬胸腺（a）、脾臟（b）總一氧化氮合酶（TNOS）活力的影響

圖3 COS對(duì)仔豬胸腺（a）、脾臟（b）iNOS活力的影響

圖4 COS對(duì)仔豬胸腺（a）、脾臟（b）cNOS活力的影響

2.2 COS對(duì)仔豬胸腺、脾臟CAT活力的影響

檢測(cè)飼料中添加COS對(duì)仔豬胸腺、脾臟CAT活力的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖5，COS組的仔豬胸腺的CAT活力較空白對(duì)照組提升了45.6%（P＜0.01），脾臟CAT活力比空白對(duì)照組提升了49.3%(見(jiàn)圖5)。因仔豬樣品個(gè)體差異較大，所有試驗(yàn)結(jié)果方差較大，所以未標(biāo)記的均沒(méi)有顯著性差異。

3 小結(jié)與討論

圖5 COS對(duì)仔豬胸腺（a）、脾臟（b）CAT活力的影響

隨著對(duì)人體健康、環(huán)境保護(hù)概念的認(rèn)知程度日益增高，對(duì)畜牧業(yè)的要求也日漸升高。由于市場(chǎng)需求和經(jīng)濟(jì)效益，人們往往通過(guò)生長(zhǎng)激素、抗生素等促進(jìn)家禽、家畜的生長(zhǎng)和免疫力的增強(qiáng)，然而激素和抗生素的不當(dāng)使用對(duì)人們的健康和安全造成了很大的困擾[11]，因而天然產(chǎn)物飼料添加劑的開發(fā)日益受到關(guān)注[12]，日本早在20世紀(jì)就已經(jīng)開始將寡糖應(yīng)用在食品和飼料添加劑中。COS是由殼聚糖降解獲得的，由2～10個(gè)糖單位的糖苷鍵鏈接而成的寡聚物，在抗炎、抗腫瘤、促生長(zhǎng)、增強(qiáng)免疫等方面均表現(xiàn)出良好的生物活性功能。本研究將COS添加到仔豬飼料中，檢測(cè)COS可能對(duì)仔豬免疫性能產(chǎn)生的影響，并嘗試推測(cè)其作用機(jī)制，以便為其在畜牧業(yè)的應(yīng)用研究提供一定的參考。

本文主要對(duì)飼料中添加COS對(duì)仔豬胸腺、脾臟免疫酶活力的影響進(jìn)行了檢測(cè)。NOS是催化L-精氨酸與O2生成NO的合成酶，研究表明NO的降低與衰老和眾多老年疾病有關(guān)。cNOS主要分布在內(nèi)皮組織和神經(jīng)系統(tǒng)，負(fù)責(zé)基礎(chǔ)NO的合成，調(diào)節(jié)各種生理功能。iNOS在受到脂多糖等刺激后會(huì)大量釋放非生理濃度的NO，產(chǎn)生一系列病理作用。從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，COS對(duì)仔豬胸腺NOS活力有顯著的提升作用。并且鑒于對(duì)胸腺NOS活力良好的作用效果，本文進(jìn)一步對(duì)樣本NOS分型活力進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胸腺cNOS活力得到大幅提升，于是本文認(rèn)為COS可能主要是通過(guò)提升cNOS活力來(lái)促進(jìn)總NOS活力的提升。羥自由基的化學(xué)性質(zhì)十分活躍，能攻擊細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)酸產(chǎn)生有毒的過(guò)氧化物，侵害體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等引起一系列細(xì)胞破壞作用。而CAT可以分解這種羥自由基，保護(hù)機(jī)體穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境。試驗(yàn)結(jié)果顯示，COS組仔豬胸腺和脾臟的CAT活力均有一定程度的提升，其中胸腺的CAT活力提升程度極為顯著，由此可見(jiàn)，COS可以通過(guò)提升仔豬免疫器官內(nèi)CAT活力來(lái)提升其免疫能力。

綜上，將COS作為免疫增強(qiáng)劑添加到飼料中能夠?qū)ψ胸i的免疫性能產(chǎn)生一定范圍的影響，推測(cè)其作用途徑可能是通過(guò)提升仔豬的免疫器官的免疫酶活力來(lái)實(shí)現(xiàn)的。