■張 怡 劉敬為 童應凱

(天津農學院農學與資源環(huán)境學院生物技術實驗室，天津 300384)

當今社會養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，但同時抗生素的大量運用也存在諸多問題，抗生素使用時間過長容易使病原菌產生耐藥性，抗生素會破壞腸道內微生態(tài)平衡，這時體外微生物就有可能入侵體內造成交叉感染[1]。而微生物制劑能夠調節(jié)動物腸道平衡，并且能抑制很多致病菌，并且有助于動物腸道蠕動，促進消化，因此，動物微生物制劑自然在畜牧業(yè)中得到廣泛的應用[2]。微生物制劑分為很多種，比如酵母菌、硝化細菌、芽孢桿菌、光合細菌、乳酸菌、EM菌等[3]，酵母菌做為非細菌性的益生菌的應用時間已久，在一定的程度上酵母菌能夠對宿主健康有積極的影響[4]。布拉酵母菌作為微生態(tài)制劑的一種，可以預防抗生素造成的菌群失調[5]。布拉酵母菌對腸出血性大腸桿菌(EHEC)[6]與腸病原性大腸桿菌(EPEC)感染[7]有預防作用，并有可抑制燒傷患者患處細菌轉運的作用[8]。凝結芽孢桿菌環(huán)境抗逆性強，能耐高溫、抗干燥、抗胃酸，并且易于存儲[9]。美國食品與藥物管理局(FDA)和美國飼料控制官員協(xié)會將其列入可用于飼料的安全微生物菌種名單[10]。固體發(fā)酵作為一種發(fā)酵方法，過程容易控制、能耗低、操作簡單、發(fā)酵產物高、對無菌要求相對較低、不易發(fā)生大面積污染[11]。本文通過將兩種菌進行混合固體發(fā)酵，提高布拉酵母菌產量，進一步提高兩種菌的益生效果。因此，本試驗以測定生物量為目的，將布拉酵母菌和凝結芽孢桿菌進行混合固體培養(yǎng)優(yōu)化，得到較優(yōu)的培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

布拉酵母菌（Saccharomyces boulardii）、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)為天津農學院生物技術實驗室保藏菌株。

1.1.2 培養(yǎng)基

① 肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%，pH值為7.2～7.4，121℃ 滅菌20 min。

② 固體培養(yǎng)基底料：豆餅粉30%、麩皮30%、玉米粉40%，1∶1加水，121℃滅菌20 min。

③YEPD培養(yǎng)基：蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖2%，115℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 搖瓶液體菌種培養(yǎng)

將凝結芽孢桿菌接種于50 ml滅菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫搖床中，轉速為150 r/min，使其處于對數(shù)生長期(濃度為1×109～10×109CFU/ml)，培養(yǎng)18～24 h后，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將布拉酵母菌接種于50 ml滅菌YEPD培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床中,轉速為180 r/min，溫度為30℃，培養(yǎng)18 h后，放入4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 添加化學試劑的布拉酵母菌與凝結芽孢桿菌混合固體發(fā)酵正交試驗

為提高布拉酵母菌的生長數(shù)量，進行正交試驗，選取L9(34)正交表(正交試驗設計見表1)。在裝有20 g固體培養(yǎng)基基料中，按正交試驗表加入不同量營養(yǎng)物質，滅菌，待培養(yǎng)基滅菌完冷卻后，加入2 ml的混合菌種子液（布拉酵母菌和凝結芽孢桿菌接種量都為5%），30℃培養(yǎng)48 h。

表1 布拉酵母菌與凝結芽孢桿菌混合固體發(fā)酵研究正交試驗設計(%)

各試驗組在30℃培養(yǎng)48 h后取出，每種樣品取1 g稀釋，用血球計數(shù)板法測量布拉酵母菌的數(shù)量。然后每種樣品再取1 g，稀釋到10-7涂布，37℃培養(yǎng)20～24 h，測量凝結芽孢桿菌數(shù)量。

1.2.3 最佳配方重復

布拉酵母菌和凝結芽孢桿菌的數(shù)量測定后，用極差分析出最佳結果，選出最佳培養(yǎng)基。然后重復最佳添加劑配方試驗，再次進行培養(yǎng)。培養(yǎng)結束測量布拉酵母菌的數(shù)量和凝結芽孢桿菌的數(shù)量。

2 結果與分析

2.1 布拉酵母菌與凝結芽孢桿菌混合固體發(fā)酵正交試驗結果（見表2）

表2 正交試驗結果分析

由于本試驗以布拉酵母菌高產為最終目標，所以觀測指標是以布拉酵母菌數(shù)量為主。凝結芽孢桿菌只作為飼料中調節(jié)腸胃劑使用，所以對其數(shù)量要求不大。經過正交試驗，布拉酵母菌和凝結芽孢桿菌的數(shù)量見表2所示，并用DPS軟件進行極差分析，根據(jù)分析結果選出最佳配方。

由R值可知，影響正交試驗結果的因素依次為A＞D＞B＞C，即影響發(fā)酵后布拉酵母菌產量的因素依次為葡萄糖、磷酸二氫鉀、蛋白胨、硫酸鎂。

從K值也可以看出，在A3B1C2D3配方下，混合固體發(fā)酵培養(yǎng)基生長的布拉酵母菌數(shù)量最多，即以固體培養(yǎng)基（包括麩皮、豆餅粉、玉米粉）為底料，加入4%葡萄糖、無蛋白胨、0.005%硫酸鎂、0.1%磷酸二氫鉀，5%接種量，30℃培養(yǎng)48 h，布拉酵母菌與凝結芽孢桿菌混合固體發(fā)酵培養(yǎng)基能得到較高產量的布拉酵母菌。

2.2 正交試驗相關性分析

根據(jù)2.1正交試驗結果，對各因素做相關性分析，結果如表3所示。

表3 相關性分析

由表3所示，對于布拉酵母菌來說，葡萄糖、磷酸二氫鉀和硫酸鎂為正相關，蛋白胨為負相關。對于凝結芽孢桿菌來說，四個因素均為負相關。

結合兩組相關性數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)中蛋白胨均為負相關。在發(fā)酵底物中含有豐富的氮源，豆餅粉、玉米粉都可以作為菌種的氮源，所以在發(fā)酵底物中不需要再過多添加氮源。說明在培養(yǎng)基添加劑優(yōu)化中可以嘗試少添加蛋白胨或者不再添加其它氮源，從而提高布拉酵母菌及凝結芽孢桿菌數(shù)量。

在表3中，葡萄糖、硫酸鎂和磷酸二氫鉀的添加對凝結芽孢桿菌數(shù)量均為負相關，對布拉酵母菌數(shù)量為正相關。說明這三個因素的添加只利于布拉酵母菌的生長，不利于凝結芽孢桿菌的生長，所以在實際生產中，可根據(jù)兩菌種的需求量，平衡調整三個因素的添加量。由于本試驗要求以布拉酵母菌數(shù)量為主要指標，所以在不過多影響凝結芽孢桿菌數(shù)量的前提下可以稍微提高三個因素添加量。

2.3 重復試驗結果與分析

重復試驗如下做兩組：取10 g固體發(fā)酵培養(yǎng)基，1∶1加水，混合均勻，加入4%葡萄糖，不加蛋白胨，0.005%硫酸鎂，0.1%磷酸二氫鉀，滅菌。然后接入1 ml布拉酵母菌和1 ml凝結芽孢桿菌，30℃培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后按照先前的方法測量布拉酵母菌和凝結芽孢桿菌的含量。測量結果見表4。

表4 最佳配方重復試驗

由表4可知，此次重復試驗結果布拉酵母菌含菌量高于正交試驗中數(shù)值，表示最佳配方確實提高了布拉酵母菌數(shù)量。而凝結芽孢桿菌沒有高于正交試驗中最大值，但也處于相對較多的水平上。結合2.2中相關性分析，重復試驗結果剛好驗證相關性分析結論。由于飼料中主要數(shù)據(jù)指標為布拉酵母菌數(shù)量，所以優(yōu)化后配方在保證布拉酵母菌數(shù)量最大化的前提下，盡量加大了凝結芽孢桿菌數(shù)量，達到二者兼顧的目的，初步判斷此配方成立。

3 討論與結論

①在接種的時候一定要均勻的將菌種接入到固體培養(yǎng)基中。在固體培養(yǎng)基中菌體活動能力沒有在液體培養(yǎng)基中強，接種不均勻可能導致菌體生長不統(tǒng)一，獲得營養(yǎng)成分不一致等問題，會給試驗結果帶來影響。而且，固體發(fā)酵底料要妥善保存，避免染菌變質導致營養(yǎng)被消耗。

②通過對布拉酵母菌與凝結芽孢桿菌混合固體發(fā)酵正交試驗分析及相關性分析，發(fā)現(xiàn)在固體發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4%葡萄糖、不加蛋白胨、0.005%硫酸鎂、0.1%磷酸二氫鉀，各接入5%的布拉酵母菌和凝結芽孢桿菌，30℃培養(yǎng)48 h，布拉酵母菌與凝結芽孢桿菌混合固體發(fā)酵培養(yǎng)基能得到較高產量的布拉酵母菌。