■黃 靈 李小梅 舒 琥 張海發(fā) 石和榮

（1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗(yàn)中心，廣東惠州 516081）

虎龍斑是由棕點(diǎn)石斑魚（E.fuscoguttatus♀）和鞍帶石斑魚（E.lanceolatus♂）雜交的新品種，具有生長速度快、成活率高、體形美觀、肉質(zhì)鮮美等優(yōu)良特性[1]。近年來，由于虎龍斑具有較好的養(yǎng)殖優(yōu)勢，在中國東南沿海地區(qū)越來越受到養(yǎng)殖戶的喜愛，人工養(yǎng)殖得到了快速發(fā)展。然而，由于集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖面積的擴(kuò)大和養(yǎng)殖密度的增加，養(yǎng)殖石斑魚的各種病害發(fā)生更加頻繁，給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。為了提高存活率，一些抗生素和化學(xué)藥物會被用來預(yù)防細(xì)菌、真菌和寄生蟲等疾病[3]。但是，抗生素和化學(xué)藥物的濫用會導(dǎo)致魚類腸道菌群失調(diào)、抗生素抗性、自身免疫力下降和嚴(yán)重食品安全等問題[4]。因此，迫切需要開發(fā)綠色無公害飼料、合理選用免疫增強(qiáng)劑等方式來提高石斑魚的抗病力，減少抗生素和化學(xué)藥物的使用。

益生菌制劑是一類有利于水產(chǎn)動物健康的微生物細(xì)胞或微生物細(xì)胞組成成分[5]。水產(chǎn)動物飼料中的益生菌制劑主要有乳酸菌類、芽孢桿菌類、酵母菌類和光合細(xì)菌等。研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加芽孢桿菌可以顯著提高吉富羅非魚（GIFT，Oreochromis niloticus）幼魚的免疫力和抗氧化能力[6]，沈斌乾等[7]在飼料中添加芽孢桿菌能促進(jìn)青魚（Mylopharyngodon piceus）魚種的生長和降低其餌料系數(shù)。王夢亮等[8]研究發(fā)現(xiàn)光合細(xì)菌促進(jìn)了鯉魚（Cyprinus carpio）腸道中益生菌的生長，提高了鯉魚腸道消化酶活性。勞惠燕等[9]在飼料中添加光合細(xì)菌復(fù)合制劑持續(xù)飼喂草魚（Ctenopharyngodon idellus）30 d和60 d，促進(jìn)了草魚的生長，提高了草魚的非特異性免疫力。李小梅等[10]以一種由光合細(xì)菌、短小芽孢桿菌和嗜酸乳桿菌組成的復(fù)合益生菌拌喂斜帶石斑魚（E.coioides）30 d，結(jié)果表明復(fù)合益生菌飼料可有效促進(jìn)斜帶石斑魚的生長和體增重，顯著提升斜帶石斑魚非特異性免疫功能。而目前還沒有關(guān)于芽孢桿菌或光合細(xì)菌對虎龍斑幼魚免疫和抗病力影響的相關(guān)研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)的目的是研究飼料中添加不同益生菌對虎龍斑免疫和抗病力的影響，為益生菌制劑在石斑魚配合飼料中的使用和探索生態(tài)健康養(yǎng)殖技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用的虎龍斑由廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗(yàn)中心提供。試驗(yàn)飼料包括基礎(chǔ)飼料、乳化魚油包裹飼料（由2%飼料量的乳化魚油包裹基礎(chǔ)飼料）、益生菌飼料（益生菌飼料由基礎(chǔ)飼料與不同用量的益生菌混勻，再以2%飼料用量的乳化魚油包裹制得）。試驗(yàn)用的基礎(chǔ)飼料由廣東越群飼料公司提供，營養(yǎng)成分見表1。試驗(yàn)用的基礎(chǔ)飼料由廣東越群飼料公司提供，粗蛋白質(zhì)含量為48.0%，粗脂肪含量為10.0%，粗纖維含量為3.0%，粗灰分含量為16.0%，水分含量為12%，鈣含量為2.0%，總磷含量為1.8%。試驗(yàn)用的益生菌為芽孢桿菌（Bacillus sp.）制劑和光合細(xì)菌(Photosynthesis bacteria)制劑，芽孢桿菌制劑分別由地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）和短小芽孢桿菌（B.pumilus）按1∶1比例混合組成，光合細(xì)菌制劑是沼澤紅假單胞菌，其中，地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌和光合細(xì)菌的有效活菌數(shù)分別為1.0×109、2.0×109cfu/g和1.0×109cfu/g。

表1 試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料基本營養(yǎng)成分(%)

1.2 試驗(yàn)分組及飼養(yǎng)管理

選用540尾體重為（33.98±4.91）g、體長為（10.48±0.61）cm的虎龍斑，隨機(jī)分為6個組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)30尾魚，分別放入18個網(wǎng)箱（1.0 m×1.0 m×1.0 m）內(nèi)。分別在基礎(chǔ)飼料中拌喂低濃度0.1%的芽孢桿菌、高濃度0.5%的芽孢桿菌、低濃度1%的光合細(xì)菌和高濃度5%的光合細(xì)菌，并以2%飼料用量的乳化魚油包裹，配置成編號為Diet 1、Diet 2、Diet 3、Diet 4四種飼料作為添加組，再增設(shè)乳化魚油組和對照組。

在整個試驗(yàn)期間，每20 d測量一次虎龍斑的體重，日投喂率為體質(zhì)量的3%左右，日投喂量的多少是由上一次測量魚的總重和其固定的投喂量率共同決定的。每天定量投喂2次，分別于8:30和16:30各投喂一次。整個試驗(yàn)期間水質(zhì)如下：平均水溫27～31 ℃，鹽度25‰～30‰，pH值7.5～8.0，溶氧≧5 mg/l，氨氮≦0.04 mg/l。正式飼養(yǎng)60 d后，測定魚的體重、體長，采集魚的血液和肝臟。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生長性能指標(biāo)

試驗(yàn)結(jié)束，停食24 h后對試驗(yàn)魚進(jìn)行計(jì)數(shù)，測量體重、體長。分別按下面公式計(jì)算飼料系數(shù)、增重率、肥滿度、肝體比指數(shù)、臟體比指數(shù)和成活率。

飼料系數(shù)=投喂量(g)/[末體重(g)-初體重(g)]；

增重率(%)={[末體重(g)-初體重(g)]/初體重}×100；

肥滿度(g/cm3)=[末體重(g)/末體長3(cm3)]×100；

肝體比指數(shù)(%)=[肝臟重(g)/魚體重(g)]×100；

臟體比指數(shù)(%)=[內(nèi)臟重(g)/魚體重(g)]×100；

成活率(%)=(收獲尾數(shù)/放養(yǎng)尾數(shù))×100。

1.3.2 血清免疫指標(biāo)測定

采用穿刺尾動脈法取血，采集的血樣置于4℃冰箱靜置4 h，然后在4℃、5 000 r/min離心15 min，收集上層血清測定酶活性。血清堿性磷酸酶、血清總超氧化物歧化酶、血清溶菌酶酶活性和血清總蛋白濃度測定均按相應(yīng)試劑盒（南京建成生物工程研究所）方法進(jìn)行。

1.3.3 肝臟抗氧化指標(biāo)的測定

準(zhǔn)確稱取肝臟重量，按重量（g）∶體積（ml）=1∶9的比例加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下，制備成10%的組織勻漿，然后在4℃、3 000 r/min離心20 min，取上清液待測。肝臟上清液總抗氧化能力、還原型谷胱甘肽、過氧化氫酶和丙二醛活性均采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的相應(yīng)試劑盒測定，操作步驟按照說明書進(jìn)行。

據(jù)中國有色金屬報(bào)9月29日消息，中鋁山西新材料有限公司第二氧化鋁廠礦制工區(qū)近日來多措并舉，針對原礦漿配鈣成立項(xiàng)目攻關(guān)小組，對赤泥鈉硅比進(jìn)行攻關(guān)，使赤泥鈉硅比連續(xù)4個月完成攻關(guān)要求。

1.3.4 攻毒試驗(yàn)

飼喂結(jié)束后，用哈維氏弧菌活菌菌懸液（1×108cfu/ml）通過腹腔注射進(jìn)行攻毒，每尾0.2 ml，然后置于干凈的水族缸內(nèi)繼續(xù)飼養(yǎng)并觀察10 d，飼養(yǎng)條件和注射前相同，每天多次觀察和記錄虎龍斑的發(fā)病和死亡情況，對死亡的虎龍斑進(jìn)行解剖、細(xì)菌分離并確認(rèn)死因。按照以下公式計(jì)算：

免疫保護(hù)率(%)=[1-（免疫組死亡率/對照組死亡率）]×100。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各組數(shù)據(jù)均用SPSS17.0數(shù)據(jù)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），若差異顯著，則用Duncan's法進(jìn)行多重比較，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，統(tǒng)計(jì)結(jié)果數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 飼料中添加不同益生菌對虎龍斑生長性能的影響（見表2）

表2 飼料中添加不同益生菌對虎龍斑生長性能的影響

由表2可知，飼養(yǎng)60 d后，與對照組相比，乳化魚油組的虎龍斑所有生長性能指標(biāo)均無顯著差異（P＞0.05）。與對照組和乳化魚油組相比，Diet 2組和Diet 3組的末體重極顯著增加（P＜0.01），其它各益生菌添加組虎龍斑的末體重均顯著增加（P＜0.05），末體長各益生菌添加組都顯著增加（P＜0.05）。與對照組和乳化魚油組相比，Diet 2組和Diet 3組飼料系數(shù)極顯著降低（P＜0.01），其它各益生菌添加組飼料系數(shù)都顯著降低（P＜0.05），增重率Diet 2組和Diet 3組極顯著增加（P＜0.01），其它各益生菌添加組增重率顯著增加（P＜0.05）。末肝體比、末臟體比、肥滿度和成活率均無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 飼料中添加不同益生菌對虎龍斑血清免疫力的影響（見表3）

表3 飼料中添加不同益生菌對虎龍斑血清免疫力的影響

由表3可知，與對照組相比，乳化魚油組的虎龍斑血清總蛋白濃度、堿性磷酸酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶活性都沒有顯著差異（P＞0.05）。與對照組和乳化魚油組相比，各益生菌添加組的虎龍斑血清總蛋白濃度都顯著升高（P＜0.05），堿性磷酸酶活性Diet 2組極顯著升高（P＜0.01），其他各益生菌添加組顯著升高（P＜0.05）。血清超氧化物歧化酶Diet 2組極顯著高于對照組和乳化魚油組（P＜0.01），其他各益生菌添加組跟對照組和乳化魚油組沒有顯著差異（P＞0.05）。血清溶菌酶活性Diet 2組和Diet 3組顯著高于對照組和乳化魚油組（P＜0.05），Diet 1組和Diet 4組與對照組和乳化魚油組沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3 飼料中添加不同益生菌對虎龍斑肝臟抗氧化能力的影響（見表4）

表4 飼料中添加不同益生菌對虎龍斑肝臟抗氧化能力的影響

2.4 飼料中添加不同益生菌對虎龍斑攻毒后成活率的影響（見表5）

表5 飼料中添加不同益生菌對虎龍斑哈維氏弧菌攻毒后成活率的影響（%）

由表5可知，哈維氏弧菌攻毒之后，與對照組相比，乳化魚油組、四個益生菌添加組的免疫保護(hù)率都有一定的提升。Diet 2組獲得最大的免疫保護(hù)率，為75%；Diet 1、Diet 3和Diet 4次之，為50%；乳化魚油組最小，為25%。

3 討論

3.1 飼料中添加不同益生菌對虎龍斑生長性能的影響

芽孢桿菌被魚吃進(jìn)腸道后，可以在腸道中定植和增殖，產(chǎn)生多種氨基酸和維生素類營養(yǎng)物質(zhì)；還可以產(chǎn)生多種腸道消化酶，提高餌料利用率，從而促進(jìn)動物生長。劉波等[11]在異育銀鯽飼料中添加地衣芽孢桿菌提高了機(jī)體酶活性和生長性能，宋奔奔等[12]研究指出，短小芽孢桿菌能提高凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)體長、存活率，且顯著提高質(zhì)量增加率。光合細(xì)菌是一類不放氧而進(jìn)行光合作用的細(xì)菌總稱，具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，還有多種生理活性物質(zhì)，如B族維生素、葉酸、輔酶Q、類胡蘿卜素等。研究表明，將光合細(xì)菌按1%比例拌料投喂草魚能促進(jìn)其生長[9]，沈錦玉等[13]按1%或5%比例將光合細(xì)菌添加到飼料可以提高鯽魚（Carassius auratus）、羅非魚（Oreochromis spp）的生長。與上述研究結(jié)果一致，在本研究中以地衣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌按1∶1比例混合制成的芽孢桿菌或光合細(xì)菌分別拌料投喂虎龍斑60 d，各益生菌添加組相對于對照組和乳化魚油組的生長性能和飼料利用率有顯著增加，其中Diet 2組和Diet 3組極顯著增加，這說明飼料中添加芽孢桿菌或光合細(xì)菌促進(jìn)了虎龍斑的生長性能。

3.2 飼料中添加不同益生菌對虎龍斑血清免疫力的影響

血清中的相關(guān)免疫酶活性在預(yù)防魚類病害感染時(shí)，維持機(jī)體健康發(fā)揮著十分重要的作用。堿性磷酸酶是在所有生物體中參與許多重要功能的一種調(diào)控酶，其可以破壞有害物質(zhì)的表面分子組成，加快有害物質(zhì)的降解，防止病菌的繁殖等[14]，血清中的超氧化物歧化酶是機(jī)體內(nèi)重要一種抗氧化酶，反映機(jī)體抑制氧自由基的能力。沈文英等[15]在草魚飼料中添加芽孢桿菌顯著提高了草魚血清堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性，在飼料中添加1%的光合細(xì)菌，尖吻鱸（Lates calcarifer）血清堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性均高于對照組，但無顯著差異性[16]。在本試驗(yàn)中，各益生菌添加組堿性磷酸酶活性都顯著提高，Diet 2組的堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性極顯著提高，這說明飼料中添加芽孢桿菌或光合細(xì)菌能提高血清的堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性。另外，溶菌酶活性是魚類先天性免疫的一個重要指標(biāo)，廣泛存在于生命有機(jī)體內(nèi)，也可以分解細(xì)菌的多糖壁，從而防止病害感染和疾病[17]，蛋白是血液中的重要化合物，血清總蛋白濃度被用作能夠指示魚類是否健康的免疫參數(shù)，其含量越高，說明機(jī)體蛋白質(zhì)代謝越強(qiáng)，免疫力提高[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，益生菌可以提高血清溶菌酶活性，其中Diet 2組和Diet 3組達(dá)到了顯著水平，所有益生菌添加組虎龍斑血清總蛋白濃度含量均顯著提高，這與趙晶晶等[19]對點(diǎn)帶石斑魚的研究結(jié)果基本相一致。綜合上述分析，說明飼料中添加芽孢桿菌或光合細(xì)菌能夠提高虎龍斑血清的免疫酶活性。

3.3 飼料中添加不同益生菌對虎龍斑肝臟抗氧化能力的影響

在魚類中，非特異性免疫機(jī)制包含有嗜中性粒細(xì)胞活化、過氧化物酶的產(chǎn)生和其他炎癥因子的抑制[20]，總抗氧化能力、還原型谷胱甘肽、過氧化氫和丙二醛等抗氧化酶活性可能會受到這些應(yīng)激反應(yīng)的影響?？偪寡趸芰κ菣C(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)的綜合反映，還原型谷胱甘肽是重要的抗氧化劑之一；過氧化氫是一類能催化過氧化氫分解為水和分子氧的過氧化物酶；丙二醛是一個脂質(zhì)過氧化的重要標(biāo)志物，這說明若總抗氧化能力、還原型谷胱甘肽和過氧化氫等抗氧化酶活性提升和丙二醛水平降低，魚類的非特異性免疫力和抗病力就有可能提高。已有大量研究表明，飼料中添加芽孢桿菌對團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）、草魚肝臟總抗氧化能力、還原型谷胱甘肽和過氧化氫酶活性顯著提高，并降低丙二醛的活性[15，21]。劉振興等[22]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合益生菌能夠顯著提高日本鰻鱺（Anguilla japonica）肝臟抗氧化水平。在本試驗(yàn)中，與對照組和乳化魚油組相比，芽孢桿菌組和光合細(xì)菌組都增加了總抗氧化能力、還原型谷胱甘肽和過氧化氫的活性，降低丙二醛水平，就菌種分析來看，芽孢桿菌組對抗氧化能力的影響要比光合細(xì)菌組強(qiáng)，其中Diet 2組效果最顯著。綜合分析說明芽孢桿菌或光合細(xì)菌能夠提高虎龍斑肝臟抗氧化能力，抑制自由基的形成，降低脂質(zhì)過氧化的傷害。

3.4 飼料中添加不同益生菌對虎龍斑攻毒后成活率的影響

細(xì)菌攻毒試驗(yàn)經(jīng)常被用作經(jīng)過營養(yǎng)研究之后魚體健康狀況的一個最終指標(biāo)[23]。能夠使魚引發(fā)弧菌病的哈維氏弧菌是一種廣泛應(yīng)用在魚類免疫試驗(yàn)中的噬鹽性革蘭氏陰性菌，該菌能夠引起養(yǎng)殖系統(tǒng)或野生水生環(huán)境中的魚、蝦和貝致病，給養(yǎng)殖戶帶來了重大的經(jīng)濟(jì)損失[24]。研究表明，飼料中添加益生菌能夠顯著提高虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、蝦的抗病力和成活率[25-27]。在本研究中，飼料中添加芽孢桿菌或光合細(xì)菌提高了哈維氏弧菌攻毒之后虎龍斑的成活率，延后了其死亡出現(xiàn)時(shí)間。說明拌料投喂芽孢桿菌或光合細(xì)菌具有預(yù)防虎龍斑感染哈維氏弧菌的積極作用。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，通過對虎龍斑幼魚生長性能、堿性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶、血清總蛋白濃度、肝臟抗氧化酶活性和抗哈維氏弧菌能力的提升等綜合考慮，表明飼料中添加益生菌有利于虎龍斑的生長，降低虎龍斑的飼料系數(shù)，提升虎龍斑的免疫力。