■石 慧 邢克智 王慶奎 陳成勛 郭永軍 孫學(xué)亮 石洪玥

（天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300384）

鋅是魚體中所必需的微量元素之一，也是目前確認(rèn)的15種微量元素中生理功能最多的一種微量元素，包括參與核酸和蛋白質(zhì)的合成、能量代謝、氧化還原等生化代謝過程；對生物膜的功能和結(jié)構(gòu)起關(guān)鍵作用；能抑制脂肪過氧化或硫醇氧化；對維持動物中樞免疫器官和外周免疫器官的結(jié)構(gòu)和功能起重要作用。鋅分布于機(jī)體所有組織、器官和體液中[1]。

鋅是機(jī)體內(nèi)40多種酶的組成成分，也是200多種酶的激活分子，具有分解、合成、穩(wěn)定蛋白酶的4級結(jié)構(gòu)，并調(diào)整酶活性等多種生化作用[2]。同時鋅作為胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等酶活性所必需輔助因子,參與機(jī)體蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪等物質(zhì)的代謝[3]，直接影響消化酶的活性[4]。這些消化酶的活性直接影響對動物營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用程度，進(jìn)而影響動物生長發(fā)育狀況[5]。研究消化酶活性對了解半滑舌鰨消化蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，并為合理搭配飼料原料起積極作用[6-7]。

自20世紀(jì)70年代開始研究鋅對水產(chǎn)動物的影響以來,絕大部分的研究都集中在以硫酸鋅為鋅源確定水產(chǎn)動物鋅需要量的研究上。然而近幾年增加許多新形式，例如以乳酸鋅[8]、甘氨酸鋅[9]、堿式氯化鋅[10]、蛋氨酸鋅和硫酸鋅[11]等為鋅源研究對水產(chǎn)動物的影響。但以納米鋅為鋅源對半滑舌鰨消化酶影響的研究報道較少。

納米材料是指特征尺寸在納米數(shù)量級（通常指1～100 nm）的極細(xì)顆粒組成的固體材料[12]。在這種尺度上，納米物質(zhì)會出現(xiàn)部分與常規(guī)尺度物質(zhì)差別很大的特殊化學(xué)物理性質(zhì)[13]。物質(zhì)被納米化后其吸收、毒性和排泄方式都有所改變。納米氧化鋅具有較高的生物活性、吸收率和免疫調(diào)節(jié)功能，相對較少的納米氧化鋅既能達(dá)到促進(jìn)生物體生長的功效。同時，納米氧化鋅的熱穩(wěn)定性較好，可與多種有機(jī)物包括病毒和細(xì)菌發(fā)生氧化反應(yīng)，從而達(dá)到殺菌消毒的作用[14]。

目前，國內(nèi)飼料工業(yè)、畜牧業(yè)已經(jīng)研究和應(yīng)用納米技術(shù)，許多飼料原料均可利用納米化技術(shù)進(jìn)行處理，諸如某些礦物質(zhì)、微量元素經(jīng)過納米化處理后,不僅能充分被動物吸收，最大限度地提高其生物利用率，并可衍生出許多新的物理性質(zhì)，而對動物產(chǎn)生新的生物學(xué)功能[15]。王天成等[16]研究結(jié)果表明，大劑量微米鋅粉與納米鋅粉對小鼠血清生化指標(biāo)的影響有明顯不同，納米鋅和微米鋅對小鼠血清生化指標(biāo)具有不同影響的機(jī)制，目前尚不清楚，這可能與納米鋅材料的特殊理化性質(zhì)有關(guān)。

本試驗(yàn)所用納米鋅直徑為20 nm，將其以不同含量添加到基礎(chǔ)飼料中，研究納米鋅對半滑舌鰨肝臟及腸道消化酶（蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶）的影響，為納米鋅在半滑舌鰨人工配合飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)采用同一批次、健康的半滑舌鰨（52.68±0.13）g作為試驗(yàn)用魚，試驗(yàn)魚取自天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司。試驗(yàn)用納米鋅由南京先豐納米材料科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)開始前將試驗(yàn)魚馴化14 d，馴化期間喂食不添加納米鋅的基礎(chǔ)飼料(見表1)。在基礎(chǔ)飼料中分別添加0、30、60、90、120、180 mg/kg納米鋅（基礎(chǔ)飼料中Zn含量為53.16 mg/kg）制成6種飼料，另加一組以無機(jī)鋅（ZnSO4·7H2O含鋅量為52.29 mg/kg)為鋅源飼料用于進(jìn)行對比，共7種飼料。每個水平設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)35尾試驗(yàn)魚，共735尾。基礎(chǔ)飼料所用的秘魯魚粉、豆粕、蝦粉、酵母等原料均粉碎過60目篩，微量元素采用逐級擴(kuò)大法添加，均勻的混入基礎(chǔ)飼料中，混合均勻后用飼料機(jī)制成粒徑為2 mm的顆粒狀餌料，陰干后置于-20℃冰柜中保存?zhèn)溆?。連續(xù)喂食84 d后取樣，測定肝胰臟、腸道消化酶指標(biāo)。

1.3 試驗(yàn)管理

試驗(yàn)采用流動循環(huán)海水進(jìn)行養(yǎng)殖，養(yǎng)殖系統(tǒng)由21個直徑為1 m的魚箱組成。試驗(yàn)魚先在養(yǎng)殖系統(tǒng)中馴化14 d，馴養(yǎng)階段喂食基礎(chǔ)飼料。每日投喂2次（8：00、16：00），投喂量占魚體重量的1%左右。每天觀察試驗(yàn)魚狀況，記錄死魚數(shù)目與攝食情況，依據(jù)攝食情況及時調(diào)節(jié)飼料投喂量。每天監(jiān)測水質(zhì)指標(biāo)（水溫、鹽度、溶氧、pH值、硝態(tài)氮、氨態(tài)氮），見表2。

表1 試驗(yàn)基礎(chǔ)飼料配比

表2 水質(zhì)指標(biāo)

1.4 樣品采集

連續(xù)喂食84 d后，試驗(yàn)魚停止投喂24 h后稱重取樣，每箱隨機(jī)取9尾魚，用MS-222麻醉后測量體長、體重。用無菌注射器從尾柄動/靜脈采血，其中一部分用肝素鈉（50 U/ml）抗凝，用于血液指標(biāo)的測定；另一部分不抗凝，室溫靜置4 h后，離心（4℃、3 500 r/min、10 min），收集血清，-80℃冷凍保存，用于血清生理生化指標(biāo)的測定。將其中的6尾用75%的乙醇棉球擦干魚體，冰盤上取肝胰臟及腸道（前、中、后）用于消化酶指標(biāo)的測定。

2 消化酶活力指標(biāo)測定

2.1 消化酶活力測定

2.1.1 粗酶液的制備

將取血后的試驗(yàn)魚置于冰盤內(nèi)，解剖后取出肝胰臟及腸道（分為前腸、中腸、后腸），用預(yù)冷的生理鹽水漂洗，然后將組織中的內(nèi)容物及結(jié)締組織除去，濾紙拭干后將組織剪碎，移入組織研磨器中，加入4倍樣品重量的預(yù)冷生理鹽水，勻漿后離心（4℃、4 000 r/min，15 min），取上清液，即酶粗提液。酶粗提液應(yīng)4℃保存，24 h內(nèi)測定完畢。

2.1.2 蛋白酶活力測定

用福林酚法測定。

蛋白酶活力定義：以37℃每毫克組織蛋白每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個活力單位。

蛋白酶活力單位(U/mg prot)=A/15×F/勻漿液蛋白含量，其中A為樣品測得光密度查曲線所得相應(yīng)酪氨酸含量(μg)；F為酶液最終稀釋倍數(shù)；15為反應(yīng)時間(min)。

2.1.3 脂肪酶活力測定

用甘油三酯法，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

脂肪酶活力定義：在30℃條件下，每克組織蛋白在本反應(yīng)系中與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物為一個酶活力單位。

2.1.4 淀粉酶活力測定

用碘淀粉顯色法，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定。

淀粉酶活力定義（U/mg prot）：在pH值7.0的條件下，以30 min內(nèi)每毫克組織蛋白中的淀粉酶在37℃下能完全水解10 mg淀粉為一個酶活力單位。

2.2 蛋白定量指標(biāo)測定

用考馬斯亮藍(lán)法，采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定

2.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，先將數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），差異顯著（P＜0.05）的用Duncan's法做多重比較。

3 結(jié)果

3.1 納米鋅對半滑舌鰨肝胰臟、腸道蛋白酶活力的影響(見表3)

表3 飼喂納米鋅84 d后對半滑舌鰨肝胰臟、腸道蛋白酶活力的影響（U/mg prot）

由表3可看出，添加納米鋅對半滑舌鰨肝胰臟、前腸的蛋白酶活力影響均呈先上升后下降的趨勢。

當(dāng)納米鋅的添加量為90 mg/kg時，肝胰臟的蛋白酶活力達(dá)到最高值，且顯著高于其他各組(P＜0.05)。

當(dāng)納米鋅的添加量為60 mg/kg時，前腸的蛋白酶活力達(dá)到最高值，且蛋白酶活力顯著高于除90、120 mg/kg外其他各組，隨著納米鋅添加量的加大，蛋白酶的活力逐漸降低。

中腸的蛋白酶活力在無機(jī)鋅組呈現(xiàn)最高值，而在納米鋅組添加量為90 mg/kg時呈現(xiàn)最高值，較于無機(jī)鋅組無顯著差異(P＞0.05)，且顯著高于除60 mg/kg組以外其他各組(P＜0.05)，同樣隨著納米鋅添加量的加大，蛋白酶活力逐漸降低。

后腸的最高值出現(xiàn)在60 mg/kg組，且顯著高于對照組及30 mg/kg組。添加納米鋅對蛋白酶活力的影響也呈先上升后下降的趨勢。

3.2 納米鋅對半滑舌鰨肝胰臟、腸道脂肪酶活力的影響(見表4)

表4 飼喂納米鋅84 d后對半滑舌鰨肝胰臟、腸道脂肪酶活力的影響（U/mg prot）

由表4可知，添加納米鋅對半滑舌鰨肝胰臟、腸道的脂肪酶活力影響均呈先下降后上升的趨勢。各組的最高值均出現(xiàn)在對照組，且都顯著高于無機(jī)鋅組(P＜0.05)。

當(dāng)納米鋅的添加量為60 mg/kg時，肝胰臟、中腸、后腸的脂肪酶活力均呈現(xiàn)最低值，且肝胰臟、前腸和后腸的脂肪酶活力顯著低于對照組(P＜0.05)。

當(dāng)納米鋅的添加量為90 mg/kg時，前腸的脂肪酶活力最低，且顯著低于對照組(P＜0.05)，較于無機(jī)鋅組均無顯著差異(P＞0.05)。

3.3 納米鋅對半滑舌鰨肝胰臟、腸道淀粉酶活力的影響(見表5)

表5 飼喂納米鋅84 d后對半滑舌鰨肝胰臟、腸道淀粉酶活力的影響（U/mg prot）

由表5可知，添加納米鋅對半滑舌鰨肝胰臟及前腸的影響均為先上升后下降的趨勢。

當(dāng)納米鋅的添加量為120 mg/kg時，肝胰臟、前腸的淀粉酶活力均呈現(xiàn)最高值，肝胰臟的蛋白酶活力顯著高于除添加量為90 mg/kg以外其他各組(P＜0.05)。前腸蛋白酶活力顯著高于除添加量180 mg/kg以外其他各組(P＜0.05)。

添加納米鋅對半滑舌鰨中腸的影響隨著納米鋅添加量的增加，淀粉酶的活力也隨之增加，但中腸的淀粉酶活力最高值出現(xiàn)在無機(jī)鋅組，且顯著高于添加納米鋅各組(P＜0.05)。

當(dāng)納米鋅的添加量為30 mg/kg時，半滑舌鰨后腸淀粉酶的活力呈現(xiàn)最高值。除顯著高于添加納米鋅90 mg/kg外(P＜0.05)，較其他各組無顯著差異(P＞0.05)。

4 討論

4.1 鋅對水產(chǎn)動物蛋白酶活力的影響

魚類消化酶活性的高低直接關(guān)系到魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用[17]，其酶活性的增強(qiáng)可提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化率[18]。

蛋白酶是生物體內(nèi)的一類酵素(酶)，它們是分解蛋白質(zhì)的有效物質(zhì)。不同魚類蛋白酶的分泌部位及形式也有所不同。Jany[19]發(fā)現(xiàn)銀鯽(Carassius auratus)肝胰臟蛋白酶的活性很弱，但經(jīng)腸液激活后，其酶活性明顯升高，且高于腸蛋白酶，因此銀鯽腸道被認(rèn)為是致活酶的主要分泌場所。而倪壽文[20]的研究表明，鯉魚、草魚肝胰臟蛋白酶的活性明顯高于腸道，而鰱魚、鳙魚肝胰臟蛋白酶的活性則小于腸道。本試驗(yàn)結(jié)果表明肝胰臟的蛋白酶活性都最大，這與田相利等[21]的研究結(jié)果相一致，其次為后腸、前腸，無論添加的鋅源為無機(jī)鋅還是納米鋅，中腸的蛋白酶活力都最低。然而鋅離子對水產(chǎn)動物作用的研究結(jié)果不盡相同，Vega-Villasante等[22-23]對加州美對蝦(Farfantepenaeus californiensis)消化酶的研究表明,在1×10-2mol/l濃度下Zn2+對蛋白酶活性有抑制作用；王海英等[24]研究在5×10-3mol/l濃度下,Zn2+對大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)腸道蛋白酶活性有抑制作用。但王吉橋等[25]在研究金屬離子對仿刺參蛋白酶活性影響時表明,Zn2+對其有輕微的激活作用,相對酶活性為108.8%；王敏奇等[26]等在斷奶仔豬飼糧中添加3 000 mg/kg的氧化鋅,十二指腸內(nèi)容物總蛋白酶、胰蛋白酶的活性分別較對照組提高6.29%、25.37%。而在本試驗(yàn)中當(dāng)納米鋅的添加量為90 mg/kg時，半滑舌鰨肝臟蛋白酶顯著高于其他各組（P＜0.05)，且顯著高于無機(jī)鋅組。隨著納米鋅添加量的繼續(xù)加大，蛋白酶活力逐漸降低，這說明適當(dāng)?shù)募{米鋅添加量能提高半滑舌鰨肝臟蛋白酶活力，但添加量過大會對肝臟蛋白酶活力產(chǎn)生不利影響。

4.2 鋅對水產(chǎn)動物脂肪酶活力的影響

脂肪酶也是一種重要的酶制劑，它能夠使脂肪水解，為動物體生長以及繁殖提供能量和必需的脂肪酸[27]。有研究結(jié)果顯示，草魚和鯉魚的肝胰臟脂肪酶活性明顯高于腸道；鰱魚和鳙魚肝胰臟脂肪酶活力明顯低于腸道；尼羅非鯽的肝胰臟脂肪酶活力與腸道幾乎相等，而胃脂肪酶活性卻明顯低于肝胰臟和腸道[28]。本研究結(jié)果顯示，除納米鋅添加量90 mg/kg組外，其他各組半滑舌鰨脂肪酶活性在前腸呈現(xiàn)最高值，其次是肝胰臟，在后腸呈現(xiàn)最低值。而鋅離子對水產(chǎn)動物脂肪酶影響的研究可參考的資料不多，付新華[29]研究表明，Zn2+對大菱鲆脂肪酶具有抑制作用。這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致，無論鋅源為無機(jī)鋅還是納米鋅，半滑舌鰨肝胰臟和腸道脂肪酶的活性都有所降低。

4.3 鋅對水產(chǎn)動物淀粉酶活力的影響

淀粉酶活性的高低直接影響到魚類對食物中碳水化合物的消化能力。關(guān)于腸道淀粉酶的分布，不同研究有不同的結(jié)果：黑鱸、鯉魚、銅吻鱗鰓太陽魚、黃顙魚[30]、草魚[31]等淀粉酶在后腸活性最強(qiáng)而前腸最弱。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)納米鋅添加量為0、30、60 mg/kg時后腸淀粉酶活力均大于中腸及前腸，當(dāng)添加量增到90、120、180 mg/kg時中腸的淀粉酶活力最高，說明高劑量的納米鋅提高了淀粉酶的活力。而辛碧芬等[32]研究金屬離子對鰱魚肝胰臟淀粉酶活性的影響得出2價金屬離子對酶活力具有抑制作用。Vega-Villasante等[22-23]對加州美對蝦Farfantepenaeus californiensis消化酶的研究表明,在1×10-2mol/l濃度下,Zn2+對淀粉酶活性有明顯抑制作用；胡毅[33]研究三疣梭子蟹中腸淀粉酶活性的結(jié)果顯示，低濃度的Zn2+對淀粉酶有激活作用,高濃度則表現(xiàn)為抑制作用。而本試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，當(dāng)納米鋅的添加量為120 mg/kg時肝胰臟、前腸、后腸淀粉酶的活力最大，隨著納米鋅添加量的繼續(xù)增大淀粉酶的活性呈現(xiàn)降低趨勢；而對半滑舌鰨中腸淀粉酶的影響來說，雖然隨著添加量的增加淀粉酶活性也隨之增加，但是影響不顯著，而添加無機(jī)鋅組淀粉酶活力顯著高于納米鋅組。