川芎嗪對PGcABCG-2蛋白影響的研究

楊棟1，張培彤1*，王耀焓1，郭秀偉1，馬雪曼2

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科,北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

摘要：目的研究川芎嗪對肺癌PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞ABCG-2蛋白表達(dá)的影響。方法采用無血清成球培養(yǎng)法分選PG-BE1中的干細(xì)胞樣細(xì)胞亞群，并檢驗(yàn)其干性,采用MTT法檢測PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞與原代細(xì)胞對常用化療藥的耐藥性。采用Western blot法檢測PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞與原代細(xì)胞ABCG-2蛋白表達(dá)及不同濃度川芎嗪對ABCG-2蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果PG-B1干細(xì)胞樣細(xì)胞的干細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)及克隆灶形成數(shù)目與原代細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞化療藥耐藥性強(qiáng)于原代細(xì)胞；PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞ABCG蛋白表達(dá)高于原代細(xì)胞；川芎嗪對ABCG蛋白的表達(dá)有抑制作用。結(jié)論無血清成球培養(yǎng)法可有效富集PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞，PG-BE1干細(xì)胞較其原代細(xì)胞有更強(qiáng)的耐藥性，這可能與其高表達(dá)ABCG-2蛋白有關(guān),川芎嗪對PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞ABCG-2蛋白有抑制作用。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞耐藥;肺癌干細(xì)胞;ABCG-2;川芎嗪

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.024

中圖分類號：R273文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)08-0833-04

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81173450)；國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(81302963)。

作者簡介:楊棟(1985-)，男，博士研究生，醫(yī)師，主要從事肺癌血瘀證研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：趙玉芝2014-03-06)

*通信作者:張培彤，電話-13910678101，電子信箱-zhangpeitong@sohu.com

Study on the effect of TMP on the expression of PGcABCG-2 protein

YANG Dong1,ZHANG Peitong1*,WANG Yaohan1,GUO Xiuwei1,MA Xueman2

(1.Department of Oncology,Guang’anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Science,Beijing 100053,China;

2.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract:ObjectiveTo study on the effect of TMP,which is the effective composition of Chuanxiong,on the expression of ABCG-2 protein of high metastatic human lung cancer(PG-BE1) cells.MethodsFirst of all,we sort the cancer stem cell(CSC) subgroup from the high metastatic human lung cancer cells(PG-BE1) by serum free sphere culture method and examine the properties of stem cells.MTT is used to exam the resistance to common chemotherapy medicine of the PG-BE1 CSC like cells and parental cells. Then we use the western blot experiment to verify the expression of ABCG-2 protein in the PG-BE1 CSC like cells and parental cells and the influence of different concentration of TMP on the expression of ABCG-2 protein.ResultsThe number of clone formation and the expression of CSC related protein show significant differences.PG-BE1 CSC cells have stronger chemotherapy resistance than parental cells.The expression of ABCG-2 protein is higher than parental cells.TMP can inhibit the expression of ABCG-2 protein.ConclusionThe serum free sphere culture method can effective enrich the CSC like cells and the PG-BE1 CSC like cells show stronger chemothrepy resistance than their parental cells.High expression of ABCG-2 protein may contribute to the themotherapy resistance.TMP can inhibit the expression of the ABCG-2 protein of PG-BE1 CSC like cells.

Keywords:chemotherapy resistance;lung cancer stem cells;ABCG-2;Ligustrazine

腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance,MRD)是腫瘤化療失敗和療后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，逆轉(zhuǎn)MRD是增強(qiáng)化療療效和減少腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。關(guān)于MRD的產(chǎn)生，學(xué)者多從細(xì)胞藥物外排能力增強(qiáng)、細(xì)胞靶標(biāo)變異、DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)及凋亡逃避等角度解讀。腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)是近年來被發(fā)現(xiàn)的腫瘤組織中含量極少但對腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等起關(guān)鍵作用的細(xì)胞亞群，因CSCs具有高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、多處于靜息期、DNA損傷修復(fù)能力強(qiáng)、高表達(dá)凋亡抑制基因等生物學(xué)特性，使其在細(xì)胞耐藥方面體現(xiàn)出優(yōu)勢，因而被認(rèn)為是腫瘤MRD的關(guān)鍵，靶向殺傷CSCs有望有效逆轉(zhuǎn)MRD。

1材料

高轉(zhuǎn)移性人巨細(xì)胞肺癌細(xì)胞PG-BE1，由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤研究室提供。Human FGF-basic：美國Pepro Tech公司，貨號：AF-100-18B;Human EGF：美國Pepro Tech公司，貨號：AF-100-15;B27 Supplement(50×):美國Gibco公司，貨號：7504-044；MTT：美國Sigma公司，貨號：M2128；OCT-4 antibody：美國CST公司，貨號：2750;SOX-2 antibody：美國CST公司，貨號：3579;Nanog antibody:美國CST公司，貨號：4893;β-Actin(13E5) Rabbit mAb:美國CST公司，貨號：4970；Anti-BCRP/ABCG2 antibody[BXP-21]:美國abcam公司，貨號：ab3380；Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)：美國abcam公司，貨號：ab97051;Goat F(ab’)2 polyclonal Secondary Antibody to mouse IgG+IgM+IgA-H&L(HRP):美國abcam公司，貨號：ab6006；鹽酸川芎嗪：中國藥品生物制品鑒定所，批號：110817-200305；順鉑(DDP)注射液：云南個(gè)舊生物藥業(yè)有限公司，批號：H53021740；紫杉醇注射液：北京協(xié)和藥廠，產(chǎn)品批號：130907；注射用鹽酸吉西他濱：江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；產(chǎn)品批號：140105；凝膠成像分析系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司；酶標(biāo)儀：美國BioTek公司，型號：SIAFRT SYNERGYHT。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)與干細(xì)胞分選常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)PG-BE1細(xì)胞，待其進(jìn)入指數(shù)生長期,胰酶消化后用PBS反復(fù)清洗3遍，重懸于含有1%雙抗、20 μg/L FGF、20 μg/L EGF、2% B27及5 μg/mL insulin的DMEM/F12培養(yǎng)基中，調(diào)整其濃度為2×104cells/mL，后接種于超低吸附6孔板中，每孔接種2 mL，待細(xì)胞成球且細(xì)胞球表面顏色變暗，折光度變低時(shí)收集細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

2.2平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測PG-BE1成球細(xì)胞與原代細(xì)胞克隆形成能力收集PG-BE1原代細(xì)胞及成球細(xì)胞，消化后重懸于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，調(diào)整其濃度為200 cells/mL，分別接種于6孔板中，每孔接種2 mL，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，后棄去培養(yǎng)液，95%乙醇固定后行結(jié)晶紫染色,倒置顯微鏡下(40倍)觀察每孔隨機(jī)5個(gè)視野下超過10個(gè)細(xì)胞的克隆灶的數(shù)目。

2.3Western blot法檢測PG-BE1成球細(xì)胞與原代細(xì)胞OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表達(dá)收集PG-BE1原代細(xì)胞及成球細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定各組總蛋白濃度，分別制備濃縮膠與分離膠，加樣后分別行蛋白電泳、電轉(zhuǎn)移,5%脫脂奶粉封閉后，一抗(稀釋倍數(shù)為1∶1 000)、二抗(稀釋倍數(shù)為1∶2 000)孵育各1 h，后于暗室中滴加超敏發(fā)光液孵育5 min，于凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用Quantity one軟件分析各組蛋白表達(dá)量。

2.4MTT法檢測PG-BE1原代細(xì)胞與干細(xì)胞樣細(xì)胞的化療藥耐藥性收集PB-BE1原代細(xì)胞及干細(xì)胞樣細(xì)胞，重懸于PBS緩沖液中，調(diào)整其濃度為5×104個(gè)/mL。上述兩種細(xì)胞均隨機(jī)分為順鉑組、吉西他濱組及紫杉醇組(各化療藥均設(shè)置高、中、低不同濃度)，各組細(xì)胞經(jīng)藥物干預(yù)后接種于96孔板中，每孔接種200 μL。培養(yǎng)48 h后向各孔內(nèi)加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出各孔中液體,向各孔加入DMSO 150 μL，于低速震蕩板上震蕩10 min后，于酶標(biāo)儀上490 nm處測得各孔吸光值，根據(jù)各孔吸光值，計(jì)算各組細(xì)胞生長抑制率。

細(xì)胞生長抑制率=[(對照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/對照組OD值]×100%

2.5Western blot法檢測PG-BE1原代細(xì)胞與干細(xì)胞樣細(xì)胞以及川芎嗪干預(yù)后PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞ABCG-2蛋白表達(dá)分別收集PG-BE1原代細(xì)胞、干細(xì)胞樣細(xì)胞(分常氧環(huán)境和低氧環(huán)境,低氧環(huán)境為5%O2、5%CO2、90%N2)以及經(jīng)高(500 μg/mL)、中(300 μg/mL)、低(100 μg/mL)濃度川芎嗪干預(yù)后的PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞，按2.3步驟行ABCG-2蛋白含量檢測。

2.6統(tǒng)計(jì)方法采用專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞與原代細(xì)胞的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析,多組內(nèi)兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)。

3結(jié)果

3.1PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞分選接種后第3天，可見有小球體形成，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，球體體積逐漸增大，至第6天時(shí)，細(xì)胞球球體顏色變暗，折光度降低。

注：圖A1為貼壁生長的PG-BE1細(xì)胞，圖A2-8分別為剛接種及1～6 d的干細(xì)胞球形成情況。 圖1　倒置顯微鏡觀察PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞形成(×200)

3.2PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞與原代細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)PG-BE1成球細(xì)胞與原代細(xì)胞的平板克隆灶形成數(shù)目分別為(3.94±1.06)個(gè)和(8.06±1.31)個(gè)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，鏡下可見克隆灶呈散在分布，每個(gè)克隆灶由多個(gè)細(xì)胞組成，呈較規(guī)則的圓形。

注:圖B1為平板克隆形成實(shí)驗(yàn)所用的6孔板，其中，上3孔為PG-BE1細(xì)胞，下3孔為PG-BE1 sphere細(xì)胞；圖B2為倒置顯微鏡下克隆灶形態(tài)(結(jié)晶紫染色法，×200) 圖2　PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞與原代細(xì)胞平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

3.3PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞與原代細(xì)胞OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表達(dá)PG-BE1成球細(xì)胞表面的干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)志SOX-2、OCT-4、Nanog的表達(dá)均高于原代細(xì)胞(見圖3)，以原代細(xì)胞光密度值作為參照值，成球細(xì)胞SOX-2、OCT-4、Nanog的相對光密度值分別為(1.99±0.59)、(1.52±0.21)、(1.44±0.36)，2種細(xì)胞比較的P值分別為0.017、0.01、0.004。見圖3。

3.4PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞與原代細(xì)胞化療耐藥比較除48 h低濃度吉西他濱條件下，PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞與原代細(xì)胞的耐藥性(生長抑制率)無區(qū)別外(P=0.878)，在24,48，72 h的時(shí)間點(diǎn)上，PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞對DDP、吉西他濱、紫杉醇的耐藥性均強(qiáng)于其原代細(xì)胞(P<0.05)。

圖3　SOX-2、OCT-4、Nanog蛋白表達(dá)

3.5Western blot法檢測各組細(xì)胞ABCG-2蛋白表達(dá)常氧環(huán)境下培養(yǎng)的PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的ABCG-2蛋白的表達(dá)高于PG-BE1原代細(xì)胞(P<0.001);不同濃度的川芎嗪及DDP對ABCG-2蛋白的表達(dá)有一定的抑制作用(P<0.05)，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

注:圖E1為不同氧濃度下PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞及其原代細(xì)胞ABCG-2蛋白表達(dá);圖E2為不同濃度川芎嗪對PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞ABCG-2蛋白表達(dá)影響。 圖4　不同組別ABCG-2表達(dá)

4討論

腫瘤化療耐藥是制約化療療效和療后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，探索化療耐藥機(jī)制及尋找逆轉(zhuǎn)化療耐藥藥物是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。CSCs是具有異質(zhì)性的腫瘤組織中含量極少的一個(gè)細(xì)胞亞群，在腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中起關(guān)鍵作用。近年來的研究表明，CSCs是引起化療耐藥的關(guān)鍵因素[1-2]，本研究中MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞在24，48，72 h對DDP、吉西他濱、紫杉醇的耐受性多強(qiáng)于其原代細(xì)胞，說明PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞相對于其原代細(xì)胞有更強(qiáng)的化療耐藥性，與絕大多數(shù)國內(nèi)外文獻(xiàn)所給出的結(jié)論一致。

CSCs具有耐藥性的原因之一在于高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這已在肝癌[3]、卵巢癌[4]、鼻咽癌[5]、前列腺癌[6]、腎癌[7]等絕大多數(shù)人類惡性腫瘤中得到證實(shí)。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用ATP水解所釋放的能量將細(xì)胞中的藥物、代謝物、核苷酸、肽類、內(nèi)源性脂質(zhì)等物質(zhì)逆濃度梯度泵出胞外。依據(jù)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能將進(jìn)入細(xì)胞中的Hoechst33342等熒光染料排除出細(xì)胞的原理,可以將細(xì)胞系中高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的細(xì)胞分選出來，即所謂的SP(side population,SP)細(xì)胞。進(jìn)一步的研究證實(shí)，SP細(xì)胞多表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志[8]和具有干細(xì)胞生物學(xué)特性[9-10]，因而被認(rèn)為是干細(xì)胞樣細(xì)胞。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)，PG-BE1干細(xì)胞樣細(xì)胞的ABCG-2蛋白的表達(dá)明顯高于其原代細(xì)胞，與上述文獻(xiàn)中的結(jié)論一致。

川芎嗪是常用活血藥川芎的有效成分，具有鈣離子通道阻滯活性，被認(rèn)為有可能通過抑制ATP依賴的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)而有助于逆轉(zhuǎn)化療耐藥。魏志霞[11]研究發(fā)現(xiàn),川芎嗪對肝癌多藥耐藥細(xì)胞SMMC-7221/ADM的耐藥性有一定的逆轉(zhuǎn)作用，其逆轉(zhuǎn)耐藥作用可能與其抑制細(xì)胞表面多藥耐藥蛋白P-gp的表達(dá)下調(diào)，從而減少細(xì)胞毒性藥物外排有關(guān),類似的研究結(jié)論在卵巢癌[12]、乳腺癌[13]、惡性淋巴瘤[14]、胃癌[15]、結(jié)腸癌[16]等的研究中亦得到證實(shí)。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)不同濃度川芎嗪對ABCG-2的表達(dá)均有一定的抑制作用，不同濃度之間的抑制作用無差異，川芎嗪對ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制作用可能會對腫瘤多藥耐藥產(chǎn)生一定的逆轉(zhuǎn)作用。

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