■王 燕 文奇男 劉曉蘭 孟祥偉 張永根 鄭喜群

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.遼寧省農(nóng)牧業(yè)機(jī)械研究所有限公司，遼寧沈陽(yáng) 110036；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

我國(guó)年產(chǎn)秸稈總量已經(jīng)超過(guò)了7億噸，居世界第一位，由于缺乏有效的處理手段大量的秸稈被露天焚燒，造成了環(huán)境污染，浪費(fèi)了寶貴的資源。玉米秸稈粗蛋白質(zhì)含量一般在3.6%～6.0%之間，且品質(zhì)不佳，能量消化率只有40%～50%，且適口性差，改善玉米秸稈飼料的適口性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是開(kāi)發(fā)其作為飼料資源的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[1]。.玉米秸稈的處理方法包括物理處理、化學(xué)處理、物理化學(xué)綜合處理和微生物處理方法等，而在眾多秸稈利用的方法中，微生物發(fā)酵處理秸稈的適口性好，能夠明顯增強(qiáng)禽畜的食欲，且產(chǎn)生的各種酶類(lèi)能夠?qū)⑿笄蓦y消化吸收的粗蛋白以及纖維等大分子的物質(zhì)分解成易于消化吸收的氨基酸及葡萄糖等小分子的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而提高飼料轉(zhuǎn)化率及其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]。該方法還可以縮短玉米秸稈飼料青貯和黃貯時(shí)間，延長(zhǎng)貯存的保質(zhì)期；同時(shí)，其工藝流程沒(méi)有廢水污染問(wèn)題，對(duì)環(huán)境污染較小，適合大力發(fā)展。微生物又是尚未被充分開(kāi)發(fā)利用的三大生物資源之一，而秸稈生物發(fā)酵飼料能將上述兩方面有機(jī)結(jié)合起來(lái)。用微生物發(fā)酵將纖維素、半纖維素等水解成葡萄糖的生物轉(zhuǎn)化工藝，對(duì)緩解世界糧食危機(jī)，提高秸稈廢棄物資源利用水平都具有十分重要的意義。開(kāi)發(fā)新的飼料資源是解決畜牧業(yè)飼料不足的有效途徑之一。因此，加強(qiáng)基礎(chǔ)理論研究和應(yīng)用研究，將為玉米秸稈資源和微生物資源的開(kāi)發(fā)利用提供廣闊的前景。

1 材料和方法

1.1 發(fā)酵菌種篩選

分別對(duì)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、好食性脈孢霉、熱帶假絲酵母、米曲霉、黑曲霉、乳酸菌進(jìn)行適宜培養(yǎng)基和玉米秸稈培養(yǎng)基培養(yǎng)初篩，確定混菌發(fā)酵所用的菌種。半纖維素降解率參照李華等[3]的方法測(cè)定，可溶性蛋白增加率參照龐崢[4]方法測(cè)定。

1.2 混菌發(fā)酵條件優(yōu)化

以玉米秸稈為主要原料，麩皮為輔料，首先采用單因素法進(jìn)行混菌固態(tài)發(fā)酵玉米秸稈試驗(yàn)，以半纖維素降解率為主要指標(biāo)，可溶性蛋白增加率為次要指標(biāo)，對(duì)菌種配比、接種量、碳源含量、氮源含量、鈣離子含量、培養(yǎng)基含水量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行條件優(yōu)化。半纖維素酶活的測(cè)定方法參照費(fèi)笛波等（2004）[5]方法測(cè)定，蛋白酶活測(cè)定方法參照福林酚法[6]測(cè)定。

1.3 發(fā)酵玉米秸稈營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

采用SDS蛋白質(zhì)電泳[7]，凝膠成像儀掃描拍照后，掃描圖像利用Gel-Pro Analyzer軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種初篩結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1～圖7。

圖1 枯草芽孢桿菌對(duì)比圖

由圖1～圖7可以看出，黑曲霉、米曲霉、乳酸菌和熱帶假絲酵母在適宜培養(yǎng)基和玉米秸稈培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況比較良好；好食性脈孢霉在兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況均不理想；枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌均可以在各自適宜培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，在玉米秸稈培養(yǎng)基上幾乎不生長(zhǎng)。綜上所述，初步確定對(duì)黑曲霉、米曲霉、熱帶假絲酵母和乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵菌種復(fù)篩。

2.2 優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基

本試驗(yàn)選用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，發(fā)酵的初始條件為玉米秸稈和麩皮分別是6.4 g和1.6 g，硫酸銨為3%，料水比為1∶1.5，接種量6%（v/w），黑曲霉∶乳酸菌的比例是1∶1，以半纖維素含量為主要指標(biāo)，可溶性蛋白含量為次要指標(biāo)，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基的條件優(yōu)化。

圖2 地衣芽孢桿菌對(duì)比圖

圖3 好食性脈孢霉對(duì)比圖

圖4 熱帶假絲酵母對(duì)比圖

2.2.1 菌種配比的優(yōu)化

玉米秸稈粉6.4 g、麩皮1.6 g為發(fā)酵底物，硫酸銨為3%，料水比為1∶1.5，接種量6%（v/w），黑曲霉∶乳酸菌分別按 1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1、3∶2、2∶3，33℃恒溫靜置培養(yǎng)72 h。以半纖維素為主要指標(biāo)，可溶性蛋白為次要指標(biāo)進(jìn)行選擇菌種配比，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖5 米曲霉對(duì)比圖

圖6 黑曲霉對(duì)比圖

圖7 乳酸菌對(duì)比圖

由圖8所示，半纖維素降解率最高的是1∶2，其次是2∶3和1∶3，可溶性蛋白的增加率最高的是1∶1，其次是3∶2和2∶1。研究表明黑曲霉∶乳酸菌=1∶2和2∶3時(shí)，半纖維素降解率最高且兩者間無(wú)明顯差別，但黑曲霉∶乳酸菌=1∶2時(shí)可溶性蛋白含量相對(duì)較高。黑曲霉∶乳酸菌=1∶1和3∶2時(shí)，兩者半纖維素降解率差別在誤差范圍內(nèi)，但黑曲霉∶乳酸菌=1∶1的可溶性蛋白含量明顯高于黑曲霉∶乳酸菌=3∶2。綜上所述，菌種配比對(duì)發(fā)酵程度的影響從大到小依次為1∶2＞1∶1＞3∶2。因此，確定最終菌種配比為1∶2。

圖8 菌種配比優(yōu)化

2.2.2 接種量的優(yōu)化

玉米秸稈粉6.4 g、麩皮1.6 g為發(fā)酵底物，硫酸銨為3%，料水比1∶1.5，接種量分別為4%、6%、8%、10%、12%（v/w），黑曲霉∶乳酸菌=1∶1，33 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 接種量?jī)?yōu)化

由圖9可以看出，接種量為8%（v/w）時(shí)，半纖維素降解率和可溶性蛋白增加率均處于最優(yōu)化水平，與其他試驗(yàn)組相比，表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。工廠大規(guī)模生產(chǎn)要求接種量一般控制在10%以?xún)?nèi)，本試驗(yàn)接種量恰好符合常規(guī)生產(chǎn)要求。因此，確定最終接種量為8%（v/w）。

2.2.3 碳源含量的優(yōu)化

玉米秸稈粉與麩皮的比例按7.2∶0.8、6.4∶1.6、5.6∶2.4、4.8∶3.2、4.0∶4.0，硫酸銨為3%，料水比1∶1.5，接種量6%（v/w），黑曲霉∶乳酸菌=1∶1，33 ℃靜置培養(yǎng)72 h。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 碳源含量?jī)?yōu)化

由圖10可以看出，玉米秸稈粉∶麩皮=5.6∶2.4時(shí)，半纖維素降解率明顯高于其他試驗(yàn)組，且除玉米秸稈粉∶麩皮=7.2∶0.8外，可溶性蛋白增加率與其他試驗(yàn)組無(wú)明顯差別，均在誤差允許的范圍內(nèi)。雖然玉米秸稈粉與麩皮比例為7.2∶0.8時(shí)可溶性蛋白增加率較高，但其對(duì)粗纖維降解能力最弱，對(duì)發(fā)酵玉米秸稈適口性和動(dòng)物胃腸道有直接影響。綜上所述，確定玉米秸稈粉與麩皮的比例為5.6∶2.4。

2.2.4 氮源含量的優(yōu)化

玉米秸稈粉6.4 g、麩皮1.6 g為發(fā)酵底物，硫酸銨分別為1%、3%、5%、7%、9%，料水比1∶1.5，接種量6%（v/w），黑曲霉∶乳酸菌=1∶1，33 ℃恒溫培養(yǎng)72 h。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖11。

圖11 氮源含量?jī)?yōu)化

由圖11可以看出，氮源含量為5%和7%時(shí)，半纖維素降解率最高，但氮源含量為7%時(shí)可溶性蛋白增加率最高。氮源含量為3%的半纖維素降解率與5%時(shí)比較，在誤差允許范圍內(nèi)，但氮源含量為3%可溶性蛋白增加率較高。綜上所述，確定影響程度大小依次為7%＞3%＞5%。因此，確定最終氮源含量為7%。

2.2.5 鈣離子含量的優(yōu)化

玉米秸稈粉6.4 g、麩皮1.6 g為發(fā)酵底物，硫酸銨為3%，料水比為1∶1.5，接種量6%（v/w），黑曲霉∶乳酸菌=1∶1，磷酸氫鈣含量分別為0.0%、0.1%、0.3%、0.5%和0.7%，33℃恒溫培養(yǎng)72 h。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖12。

圖12 磷酸氫鈣含量?jī)?yōu)化

磷酸氫鈣對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，會(huì)間接影響半纖維素降解能力和蛋白含量。由圖12可以看出，磷酸氫鈣含量為0.1%和0.5%時(shí)，半纖維素降解率和可溶性蛋白增加率均較高。但磷酸氫鈣含量為0.1%時(shí)，半纖維素降解率高于磷酸氫鈣含量為0.5%時(shí)半纖維素降解率，然而可溶性蛋白增加率差異不顯著，在誤差范圍內(nèi)。綜上所述，確定最終磷酸氫鈣含量為0.10%。

2.2.6 培養(yǎng)基含水量的優(yōu)化

玉米秸稈粉6.4 g、麩皮1.6 g為發(fā)酵底物，硫酸銨為 3%，料水比分別為 1.0∶1.1、1.0∶1.3、1.0∶1.5、1.0∶1.7、1.0∶1.9，接種量6%（v/w），黑曲霉∶乳酸菌=1∶1，33℃恒溫培養(yǎng)72 h。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖13。

由圖13可以看出，料水比為1∶1.7時(shí)，半纖維素降解率和可溶性蛋白增加率明顯高于其他試驗(yàn)組。料水比為1∶1.1時(shí)，半纖維素降解率和可溶性蛋白增加率次之。料水比為1∶1.3和1∶1.5時(shí)，可溶性蛋白增加率無(wú)顯著差別，但1∶1.5時(shí)半纖維素降解率高。綜上所述，培養(yǎng)基含水量影響程度大小依次為1∶1.7＞1∶1.1＞1∶1.5。因此，確定最終料水比為1∶1.7。

2.2.7 發(fā)酵溫度的優(yōu)化

玉米秸稈粉6.4 g、麩皮1.6 g為發(fā)酵底物，硫酸銨為3%，料水比為1∶1.5，接種量6%（v/w），黑曲霉∶乳酸菌=1∶1，發(fā)酵溫度分別27、30、33、36、39 ℃恒溫靜置培養(yǎng)72 h。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖14。

圖13 培養(yǎng)基含水量?jī)?yōu)化

圖14 發(fā)酵溫度優(yōu)化

由圖14可以看出，當(dāng)發(fā)酵溫度為33℃時(shí)，可溶性蛋白增加率較高。因此，最終確定發(fā)酵溫度為33℃。

2.2.8 發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化

玉米秸稈粉6.4 g、麩皮1.6 g為發(fā)酵底物，硫酸銨為3%，料水比為1∶1.5，接種量6%（v/w），黑曲霉∶乳酸菌=1∶1，33 ℃恒溫培養(yǎng)，發(fā)酵時(shí)間分別48、60、72、84、96 h。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖15。

由圖15可以看出，半纖維素降解能力由強(qiáng)到弱依次為60 h＞48 h＞84 h＞72 h＞96 h，可溶性蛋白增加率從大到小依次為60 h＞48 h＞72 h＞96 h＞84 h。發(fā)酵時(shí)間為72 h和84 h時(shí)，半纖維素降解率差別在誤差范圍內(nèi)，可以忽略不計(jì)。綜上所述，確定影響程度從大到小依次為60 h＞48 h＞72 h。因此，確定最終發(fā)酵時(shí)間為60 h。

2.3 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值測(cè)定結(jié)果

2.3.1 發(fā)酵后半纖維素酶活和蛋白酶活（見(jiàn)表1）

表1結(jié)果表明，按照響應(yīng)面分析的優(yōu)化條件進(jìn)行發(fā)酵后玉米秸稈底物的半纖維素酶活力200.45 U/g，發(fā)酵后的玉米秸稈底物的蛋白酶活力為120.30 U/g。

圖15 發(fā)酵時(shí)間優(yōu)化

表1 發(fā)酵后的秸稈的半纖維素酶活力和蛋白酶活力（U/g）

2.3.2 發(fā)酵后SDS測(cè)定的玉米秸稈蛋白的分子量分布（見(jiàn)表2）

表2 發(fā)酵玉米秸稈蛋白分子量分布

從表2可以看出，與原料玉米秸稈相比，發(fā)酵玉米秸稈的低分子量蛋白含量提高了172.70%（＜50 kD），高分子量蛋白含量降低了65.92%（＞100 kD）。說(shuō)明經(jīng)黑曲霉和乳酸菌混合發(fā)酵后的玉米秸稈可以將玉米秸稈中絕大部分的大分子蛋白分解成小分子蛋白，更有利于動(dòng)物的消化和吸收。

3 討論

本論文通過(guò)微生物發(fā)酵的方法提高了玉米秸稈的纖維的利用率，半纖維素酶活力達(dá)到200.45 U/g，蛋白酶活力達(dá)到120.30 U/g，這與許多研究的結(jié)果是一致的[8-10]。陳慶森等[8]以玉米秸稈為原料，利用多菌種混合發(fā)酵，經(jīng)測(cè)定發(fā)酵液中玉米秸稈的纖維利用率達(dá)70%，粗蛋白質(zhì)利用率在23%以上，大大提高了玉米秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)對(duì)替代飼用糧生產(chǎn)蛋白富集飼料提供了很好的基料。楊學(xué)霞等[9]采用固態(tài)發(fā)酵法將玉米秸稈利用微生物轉(zhuǎn)化為蛋白飼料，將玉米秸稈粗蛋白含量從6.7%提高到14.7%，同時(shí)使纖維含量降低38.0%。王石玉等[10]研究了不同氮源對(duì)擬康氏木霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的影響，結(jié)果表明，以（NH4）2SO4為氮源、添加量為2.5%時(shí)，酶活最高。方浩等[11]研究了利用里氏木霉和黑曲霉混合培養(yǎng)產(chǎn)纖維素酶的最優(yōu)條件，當(dāng)黑曲霉接種時(shí)間比里氏木霉延遲48 h、里氏木霉與黑曲霉接種量比為5∶1時(shí)，濾紙酶活最高達(dá)3.295 IU/ml，并優(yōu)于單一菌種培養(yǎng)。

本論文的優(yōu)化結(jié)果很多是以半纖維素為基礎(chǔ)的，原因是由于半纖維素和纖維素交雜在一起，只有當(dāng)纖維素被水解時(shí)，半纖維素才能全部水解[11]，半纖維素降解意味著纖維素水解完全。纖維素是由D-吡喃葡萄糖基以β-1，4糖苷鍵連接成的天然鏈狀高分子化合物，分子式為（C6H10O5）n，n為纖維素的聚合度，完全水解后得到葡萄糖。半纖維素的分子量較低，聚合度小，且分子中往往帶有支鏈。它是一大類(lèi)結(jié)構(gòu)不同的帶有支鏈的多聚糖的總稱(chēng)。組成半纖維素的結(jié)構(gòu)單元主要有木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖等，各種糖所占比例隨原料不同而變化，一般木糖占一半以上，因此木聚糖酶可以水解半纖維素。

4 結(jié)論

發(fā)酵后的玉米秸稈底物的半纖維素酶活力200.45 U/g。發(fā)酵后的玉米秸稈中高分子量蛋白含量降低了65.92%，低分子量蛋白提高了172.70%。綜上所述，混菌固態(tài)發(fā)酵玉米秸稈顯著提高了玉米秸稈的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。