·方藥研究·

正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選益視口服液純化工藝

陳亞龍，李昭，曹林林，王興海，王露，郭東艷*

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046)

摘要：目的考察殼聚糖澄清劑用于益視口服液的純化工藝。方法以益視口服液中2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的轉(zhuǎn)移率及干膏率為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選殼聚糖絮凝沉降法的純化工藝條件；并對(duì)純化前后藥液的黏度、濁度、蛋白質(zhì)及鞣質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果殼聚糖絮凝沉降法的最佳條件是藥液質(zhì)量濃度是1.0 g/mL，殼聚糖的加入量為30%，藥液pH 4，溫度是40 ℃，經(jīng)純化后黏度、濁度、蛋白質(zhì)及鞣質(zhì)含量均有所下降。結(jié)論殼聚糖絮凝沉降法可用于益視口服液的純化。

關(guān)鍵詞：殼聚糖；益視口服液；純化工藝；二苯乙烯苷；干膏率

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2015.06.006

中圖分類號(hào)：R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-6258(2015)06-1115-04

基金項(xiàng)目：陜西省重大科技創(chuàng)新項(xiàng)目(2011ZKC08-1)。

作者簡(jiǎn)介：陳亞龍(1967-)，男，碩士，副教授，主要從事中醫(yī)腎病臨床及新藥研究。

收稿日期:(2015-07-06)

*通信作者：郭東艷，女，博士，教授，電話-13992090011

Optimization of The Chitosan Purification Process of Yishi Oral Solution by Orthogonal Test

CHEN Yalong, LI Zhao,CAO Linlin,WANG Xinghai,WANG Lu,GUO Dongyan*

(Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Xianyang 712046, Shanxi Province, China)

Abstract：ObjectiveTo investigate purification technology of Yishi Oral liquid with chitosan as clarification agent. MethodThe transfer rate of 2,3,5,4’-styrene-4-hydroxy -2-O-β-D-glycosidase and extraction rate as indexes，the best purification process conditions of chitosan flocculation settlement method were optimized by using L9(34) orthogonal experiment design，and the viscosity, turbidity, the content of protein and tannin were determinated before and after purification liquid. ResultOptimum purification process of chitosan flocculation sedimentation method was：the mass concentration of liquid1.0 g/mL，the addition amount of chitosan 30%，pH 4 at 40 ℃.The viscosity, turbidity , the content of protein and tannin were decreased after purification. ConclusionChitosan flocculation settlement method can be used for purification of Yishi Oral Solution.

Keywords：chitosan；Yishi oral solution；purification process；stilbene glycosidee；extraction rate

益視口服液是由部頒標(biāo)準(zhǔn)收載品種益視顆粒(WS3-B-3307-98)改劑型而來，由黨參、當(dāng)歸、五味子(蒸)、山藥、制何首烏、金櫻子、覆盆子、厚樸(姜制)、木香、白術(shù)(焦)、山楂(焦)、石楠葉、菟絲子、六神曲(焦)等藥味組成，具有滋腎養(yǎng)肝、健脾益氣、調(diào)節(jié)視力的作用，臨床上主要用于治療肝腎不足、氣血虧虛引起的青少年近視及視力疲勞[1]。方中何首烏能補(bǔ)肝腎、益精血, 其有效成分二苯乙烯苷(2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷) 是其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一，也是制劑質(zhì)量控制中常用的指標(biāo)成分[2]。近年來，殼聚糖絮凝沉降法用于中藥提取液的純化顯示出了較好的效果[3-5]。因此本實(shí)驗(yàn)擬采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以二苯乙烯苷及干膏得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選殼聚糖絮凝的最佳工藝條件。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器Agilent1260高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器，ChemStation for LC 3D systems)；530低速離心機(jī)(湖南賽物湘離心機(jī)儀器有限公司)；PTF-A500電子天平(福州華志科學(xué)儀器有限公司)；BROOKFIELD博力飛DV-I+黏度計(jì)(美國)；WGZ-3P濁度計(jì)(上海昕瑞儀器儀表有限公司)；UV1102紫外/可見分光光度計(jì)(上海)；GB204電子分析天平(瑞士)；SHZ-B恒溫振蕩器(天津)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海))。1.2藥材與試劑試驗(yàn)用飲片由陜西昊源中藥飲片有限公司提供，經(jīng)檢驗(yàn)均符合《中國藥典》2010年版1部各飲片項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定。 牛血清蛋白(BSA)(北京典博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：120330)；考馬斯亮藍(lán)G-250(上海西寶生物科技有限公司，20130506)；皮粉(含鉻)(上海邁坤化工有限公司，批號(hào)：20140224)；色譜乙腈(Honeywell)；色譜甲醇(MREDA)；水為娃哈哈純凈水；2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：110844-201109，供含量測(cè)定用)；殼聚糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20121112)。

2 方法與結(jié)果

2.12，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量測(cè)定2.1.1色譜條件色譜柱：Thermo DBS-C18分析柱(250 mm×4.6mm，5 μm)，流動(dòng)相:水-乙腈(85∶15)，柱溫：20 ℃，檢測(cè)波長：320 nm，在此條件下，2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的峰與其他峰達(dá)到基線分離，不干擾含量測(cè)定。2.1.2對(duì)照品溶液的制備取2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每l mL含0.2 mg的溶液，即得。2.1.3水提液的制備按處方比例稱取黨參、當(dāng)歸、五味子、山藥、制何首烏、金櫻子、覆盆子、厚樸(姜制)、木香、白術(shù)(焦)、山楂(焦)、石楠葉、菟絲子、六神曲(焦)14味藥，加入10倍量水提取2 次(第1次2 h，第2次1 h)，過濾，合并濾液，濃縮至1.0 g/mL，即得水提液，備用。2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在0.1 ～2.0 μg范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。2.1.5重復(fù)性試驗(yàn)按2.1.3項(xiàng)下方法制備水提液，稀釋至適宜濃度，共5組，測(cè)定含量，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果RSD為2.10%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。2.1.6精密度試驗(yàn)取水提液，稀釋至適宜濃度，重復(fù)測(cè)定5次，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果RSD為1.12%，表明儀器精密度良好。2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)取水提液，稀釋至適宜濃度，分別在0、2、4、8、12 h測(cè)定其含量，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果RSD為1.01%，表明該供試品溶液在12 h內(nèi)均穩(wěn)定。2.1.8加樣回收率試驗(yàn)取水提液共6分，精密稱定，按照0.8∶1.0∶1.2的比例加入對(duì)照品溶液進(jìn)行加樣回收率試驗(yàn)，測(cè)定峰面積。計(jì)算平均回收率為98.53%，RSD為1.72%。2.2干膏率測(cè)定精密吸取供試品溶液10 mL，置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后放入105 ℃烘箱中，干燥5 h，取出后置于干燥器中冷卻0.5 h后稱取重量，計(jì)算干膏得率。2.3殼聚糖絮凝工藝的考察2.3.1殼聚糖溶液的配制稱取5.0 g殼聚糖，以1%醋酸為溶劑配成1%的殼聚糖溶液500 mL，備用。2.3.2單因素考察及因素水平的確定根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[6-14]，殼聚糖絮凝對(duì)中藥提取液絮凝的靜置溫度一般控制在40～50 ℃，pH一般控制在4～6，根據(jù)此條件對(duì)溫度，pH進(jìn)行了單因素考察。而殼聚糖的加入量以及藥液濃度則根據(jù)益視口服液的具體情況進(jìn)行單因素考察。2.3.2.1藥液濃度的考察藥液濃度為1.0 g/mL時(shí)，二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率最高，干膏收率略有增加。2.3.2.2殼聚糖加入量的考察結(jié)果表明，殼聚糖加入量與二苯乙烯苷及干膏收率均成反比。2.3.2.3靜置溫度的考察見表1。

表1　靜置溫度對(duì)二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率和干膏率的影響

結(jié)果表明，溫度為40 ℃時(shí)，二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率最高，干膏收率略有增加。

2.3.2.4藥液酸堿度的考察見表2。

表2　藥液酸堿度對(duì)二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率和干膏率的影響

注：原藥液 pH 值約為 4，采用10%NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH值

結(jié)果表明，不調(diào)節(jié)pH值時(shí)，二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率最高，干膏收率相對(duì)較低。

2.3.3殼聚糖絮凝正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表見表3，方差分析見表4，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表5。

表3　因素水平表

表4　正交試驗(yàn)方差分析表

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以綜合評(píng)分(綜合評(píng)分=0.6W1/W1max+0.4Wmin/W2)為考察指標(biāo)，由表5中極差值R大小顯示，各因素的作用主次為B(pH)>C(藥液濃度)>A(溫度)>D(殼聚糖的加入量)。表4方差分析結(jié)果表明，B、C因素各水平間具有顯著性差異，綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，擬定以A2B1C3D2為最佳純化工藝條件，即不調(diào)節(jié)pH、藥液濃度為1.0 g/mL，加入體積比為30%的殼聚糖溶液，于40 ℃的恒溫水浴靜置。

表5　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

注：綜合評(píng)分=0.6W1/W1max+0.4Wmin/W2，W1為二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率，W2為干膏收率

2.3.4絮凝澄清工藝的驗(yàn)證按照上述正交試驗(yàn)優(yōu)選出的最佳工藝條件，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)(n=3)。結(jié)果表明，采用不調(diào)節(jié)pH、藥液濃度為1.0 g/mL，加入體積比為30%的殼聚糖溶液，于40 ℃的恒溫水浴靜置最佳條件時(shí)，二苯乙烯苷轉(zhuǎn)移率可達(dá)到83.39%，干膏率降低到20.45%(純化前干膏率為29.37%)，且該方法比較穩(wěn)定。

2.4黏度的測(cè)定

2.4.1供試品溶液的制備取益視口服液水提液適量，按照最優(yōu)工藝條件進(jìn)行純化精制，并濃縮到適宜濃度，即得供試品溶液。

2.4.2測(cè)量轉(zhuǎn)子及轉(zhuǎn)速的選擇試驗(yàn)選擇Brook Field 博力飛DV-I黏度計(jì)的不同轉(zhuǎn)子系統(tǒng)S00、S61、S62、S63型等轉(zhuǎn)子[15]，對(duì)不同供試品溶液的適應(yīng)性進(jìn)行考察，結(jié)果：僅有S00型的轉(zhuǎn)子測(cè)得的數(shù)據(jù)穩(wěn)定且扭矩>10%，符合黏度測(cè)定要求，故選擇S00型轉(zhuǎn)子以100 RPM的轉(zhuǎn)速進(jìn)行測(cè)定。

2.4.3黏度的測(cè)定結(jié)果取供試品溶液，分別配制成濃度為0.25、0.5、0.75、1.0 g/mL的溶液，測(cè)定黏度。結(jié)果純化前濃度分別為5.43、6.21、8.98、9.79 g/mL；純化后濃度分別為2.77、3.37、4.61、7.57 g/mL。

2.5濁度的測(cè)定取供試品溶液，分別配制成濃度為0.25、0.5、0.75、1.0 g/mL的溶液，測(cè)定濁度值。結(jié)果純化前濃度分別為798.2、996.8、1 204.1、1 305.7 g/mL；純化后濃度分別為436.3、789.2、 999.7、1 013.9 g/mL。

2.6蛋白質(zhì)的測(cè)定

2.6.1測(cè)定方法1)顯色劑的配制：取G-250 100 mg，加入50 mL 95% EtOH，溶解后再加入100 mL 85%(W/V)H3PO4，用水調(diào)至1 000 mL，即為考馬斯亮藍(lán)工作液。2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密吸取牛血清蛋白試劑適量，配置濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在595 nm處進(jìn)行紫外測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程為Y=0.000 6X—0.080 2，R2=0.999 6，表明牛血清蛋白在0.1～1.0 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性范圍良好。

2.6.2測(cè)定結(jié)果吸取待測(cè)樣品0.1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250蛋白試劑5 mL，充分混合，放置2 min后測(cè)其吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算純化后蛋白質(zhì)的清除率為12.3%。

2.7鞣質(zhì)的測(cè)定

2.7.1測(cè)定方法1)量取供試品溶液(包含原藥液)各250 mL，備用。2)總水溶性部分的測(cè)定：精密量取供試液25 mL，蒸干，殘?jiān)?05 ℃干燥3 h至恒重，稱重(T1)。3)不與皮粉結(jié)合的水溶性部分的測(cè)定：精密量取供試液100 mL，加皮粉5 g，振搖15 min，濾過，精密量取濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)?05 ℃干燥3 h至恒重，稱重(T2)。4)皮粉水溶性部分的測(cè)定：精密量取水100 mL，加皮粉5 g，振搖15 min，濾過，精密量取濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)?05 ℃干燥3 h至恒重，稱重(T0)。

2.7.2測(cè)定結(jié)果以鞣質(zhì)%=(T1-T2+T0)×10/W %，計(jì)算鞣質(zhì)清除率，結(jié)果表明采用殼聚糖絮凝后，鞣質(zhì)清除率為27.5%。

3小結(jié)

澄明度是口服液的重要質(zhì)控指標(biāo)，它反映了產(chǎn)品穩(wěn)定性，是口服液制備中的關(guān)鍵問題。中藥口服液的澄明度受很多因素的影響，如pH，電導(dǎo)率，鞣質(zhì)，蛋白質(zhì)等，更重要的是中藥口服液本身就是一個(gè)不穩(wěn)定的體系。以本試驗(yàn)通過對(duì)其物理參數(shù)的考察來進(jìn)一步闡釋殼聚糖絮凝沉降工藝對(duì)該制劑的影響[16-18]。 黏度和濁度是反映中藥口服液的重要因素，在純化工藝中除要考慮其有效成分保留率的同時(shí)，對(duì)口服液的外觀性狀也應(yīng)關(guān)注。眾所周知，中藥大多為多味藥配伍組成，成分復(fù)雜多變，藥物在煎煮提取過程中除了提取出大量有效物質(zhì)外，常含有大量無效物質(zhì)，所以通過對(duì)其黏度和濁度的考察，使其在保證藥效的同時(shí)還能滿足降低黏度提高澄明度的作用。蛋白質(zhì)和鞣質(zhì)一般情況也是中藥復(fù)方中要除去的雜質(zhì)，益視口服液采用殼聚糖絮凝沉降后對(duì)其均有一定的除雜作用。但是最終純化工藝還有待于進(jìn)一步結(jié)合藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行確定。

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