研究報告

NLRP3炎癥小體在早期動脈粥樣硬化ZDF大鼠中的表達及阿托伐他汀的干預

馬全鑫1，楊欽欽1，陸曄楓2，陳小真1，陳誠1，壽旗揚1，蔡月琴1，陳民利1

(1.浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心/比較醫(yī)學研究中心，杭州310053；2.揚州大學獸醫(yī)學院，揚州225009)

【摘要】目的觀察NLRP3炎癥小體及其介導的炎癥因子在早期動脈粥樣硬化(AS)Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠主動脈組織中的表達，以及阿托伐他汀(ATV)的干預作用。方法高脂飼喂聯(lián)合小劑量多次注射VD3建立ZDF大鼠早期AS模型，并給予ATV干預；檢測血糖血脂、胰島素、ox-LDL和hsCRP，并進行主動脈組織病理學檢查和NLRP3、caspase 1、IL-1β和TNF-α基因表達的檢測。結果高脂飼喂后ZDF大鼠血糖、血脂、胰島素和ox-LDL水平均顯著上升(P<0.05)。注射VD3后，hsCRP水平均顯著上升(P<0.05)，主動脈組織出現(xiàn)明顯的早期AS病變，且NLRP3、caspase 1、IL-1β和TNF-α基因表達顯著上調(P<0.05)，而ATV組ZDF大鼠血脂、ox-LDL和hsCRP水平均明顯下降(P<0.05)，AS病變程度減輕，且主動脈組織中NLRP3、Caspase 1、IL-1β和TNF-α基因表達顯著下調(P<0.05)。結論 NLPR3炎癥小體及其介導的炎癥因子參與了ZDF大鼠早期AS的炎癥反應，而ATV可抑制NLRP3炎癥小體的表達，抑制AS的炎癥反應。

【關鍵詞】動脈粥樣硬化；NLRP3炎癥小體；2型糖尿病；ZDF大鼠

[基金項目]浙江省自然科學基金(LY12C04002)。

[作者簡介]馬全鑫(1988-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：中藥藥理與比較醫(yī)學，E-mail： mqx1025@hotmail.com。

[通訊作者]陳民利(1963-)，女，教授、碩士，研究方向：實驗動物與比較醫(yī)學，E-mail： cmli991@126.com。

【中圖分類號】R33【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.001

Expression of NLRP3 inflammasome in early atherosclerosis ZDF

rats and intervention effect of atorvastatin

MA Quan-xin1, YANG Qin-qin1, LU Ye-feng2, CHEN Xiao-zhen1, CHEN Cheng1,

SHOU Qi-yang1, CAI Yue-qin1, CHEN Min-li1

(1.Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China;

2.College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Jiangsu,Yangzhou225009 )

Abstract【】ObjectiveTo observe the expression of NLRP3 inflammasome and its mediated inflammatory factors in the aorta of Zuker diabetic fatty (ZDF) rats with early atherosclerosis(AS), and observe the intervention effect of atorvastatin. MethodsZDF rats models of type 2 diabetes mellitus(T2DM) and AS were established by feeding high-fat diet accompanied with multiple injections of vitamin D3(VD3). Meanwhile, half of these rats were also given atorvastatin(ATV). Changes of serum glucose, lipids, insulin, ox-LDL and hsCRP were tested. Morphological changes of aorta tissues were examined by histopathology. The gene expressions of NLRP3 and some other inflammatory mediators were also quantified. Results After feeding high-fat diet, the glucose, lipids, insulin and ox-LDL levels of ZDF rats in the model group were significantly increased(P<0.05).After VD3 injecting, pathological changes also occurred in the early stage AS. Moreover, the hsCRP level was increased along with elevated gene expressions of NLRP3, caspase 1, IL-1β and TNF-α in the aorta tissues (P<0.05). Nevertheless, the serum glucose, lipids, insulin, ox-LDL and hsCRP levels in ZDF rats of the ATV group were significantly decreased (P<0.05). The pathological changes were attenuated and gene expressions of NLRP3, caspase-1, IL-1β and TNF-α in the aorta tissues also significantly reduced (P<0.05). ConclusionsNLPR3 inflammasome and its mediated inflammatory mediators participate in the inflammatory responses during the early AS development. ATV can inhibit the gene expression of NLRP3 inflammasome, and alleviate the inflammatory responses during atherosclerosis.

【Key words】Atherosclerosis;NLRP3 inflammasome;Type 2 diabetes mellitus; Zuker diabetic fatty rats

動脈粥樣硬化(AS)不僅是2型糖尿病(T2DM)中最常見的大血管并發(fā)癥，也是T2DM患者致殘致死的重要原因[1]。近來，越來越多的研究者認為炎癥是AS和糖尿病共同的病理基礎，NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體是其中重要的調控因子[2]。NLRP3炎癥小體是一種蛋白質復合體，作為固有免疫的重要組分不僅在炎癥反應中發(fā)揮了關鍵作用，而且是連接炎癥與代謝性疾病的橋梁：由NLRP3介導產生的白介素(IL)-1β和IL-18會干擾胰島素的信號傳導而導致胰島素抵抗，同時IL-1β使得動脈粥樣硬化斑塊易于破裂[3]。因此，作為炎癥反應的核心，NLRP3炎癥小體可能為防治T2DM并發(fā)AS提供新的靶點。阿托伐他汀(ATV)是臨床常用的抗AS藥物，具有一定的抗炎作用。目前尚無關于ATV對NLRP3炎癥小體干預作用的報道，且NLRP3炎癥小體在T2DM并發(fā)AS動物模型中的研究較少。Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠是由Zucker肥胖(ZF)大鼠近交后得到的高血糖品系，為常用的T2DM疾病模型[4]，且伴有血管病變與炎癥反應[5]。本文采用高脂飲食聯(lián)合維生素D3(VD3)建立ZDF大鼠T2DM并發(fā)早期AS模型，研究NLRP3炎癥小體及其介導的相關炎癥因子在主動脈組織中的表達特點以及ATV的干預作用。

1材料和方法

1.1實驗動物及實驗環(huán)境

SPF級7～8周齡雄性ZDF大鼠12只及同周齡的雄性Zucker瘦型(ZL)大鼠6只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心屏障實驗室【SYXK(浙)2013-184】，環(huán)境溫度：(22±2)℃，相對濕度：50%～60%，光照： 12h/12h明暗交替，噪聲<50 db；每籠IVC籠內飼養(yǎng)2只大鼠，自由飲食，并在試驗過程中按實驗動物使用的“3R”原則給以人道主義關懷，并在適應性飼養(yǎng)1周后進行正式實驗。

高脂飼料配方：膽固醇1%、起酥油10%、蛋黃粉10%、3號膽鹽0.5%、基礎飼料78.5%。

1.2試劑與儀器

VD3注射液，購自上海通用藥業(yè)股份有限公司；ATV鈣片，輝瑞制藥有限公司生產；RNA提取試劑盒和熒光定量試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司；大鼠超敏C反應蛋白(hsCRP) ELISA試劑盒，購自杭州誠維生物科技有限公司；大鼠胰島素檢測試劑盒，購自ALPCO公司。診斷檢測試劑購自上海申能-德賽診斷技術有限公司；CD68+抗體(ab31630)購自abcam公司。7020型全自動生化分析儀(日本日立公司)，實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；Thermo光譜掃描多功能酶標儀(美國Thermo公司)，ST5010染色機(德國Leica公司)，80I相差顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.3動物實驗

取ZDF大鼠12只，連續(xù)高脂飼喂4周后，進行眼眶靜脈叢取血，測定血清膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血糖(GLU)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。根據血脂血糖及體重，分為模型組(model group)和ATV組(ATV group)，每組6只；另取6只ZL大鼠飼喂基礎飼料，作為正常對照組(control group)。ATV組ZDF大鼠每天經口灌服5 mg/kg ATV，模型組和正常對照組每天給予10 mL/kg蒸餾水。模型組與ATV組大鼠繼續(xù)飼喂高脂飼料，并經腹腔注射60萬IU/kg VD3(分3次，每隔3 d注射1次)。

1.4指標測定

1.4.1血液生化指標測定：在首次注射VD3后2，4，6周時，將所有大鼠禁食12 h后經眼眶靜脈取血1 mL，分離血清，使用全自動生化儀檢測GLU、CHOL、TG、LDL-C、HDL-C水平，并計算動脈粥樣硬化指數(shù)(AI)，AI=(CHOL-HDL-C)/HDL-C。利用ELISA試劑盒，檢測hsCRP、胰島素和ox-LDL的含量。

1.4.2主動脈病理組織學觀察[6]：首次注射VD36周后麻醉并處死動物，經左心室預冷PBS沖洗，緊貼升主動脈根部斷離心臟，立即放入4%中性甲醛中固定48 h后，從心耳下冠狀面剖切心臟。將心臟升主動脈根部切面向下包埋，用石蠟切片機將主動脈竇部切成4 μm薄片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學顯微鏡下觀察病理變化并拍照。

采用免疫組化染色方法檢測主動脈組織中巨噬細胞的浸潤。石蠟切片置于60℃培養(yǎng)箱烘烤1 h，脫蠟至水，3%過氧化氫溶液15 min阻斷內源性過氧化物酶，與anti-CD68+一抗孵育，置于4℃冰箱過夜。沖洗后與二抗結合15 min，DAB顯色，蘇木素復染，脫水封片。巨噬細胞被標記為棕黃色。

1.4.3主動脈組織NLRP3及相關炎癥因子mRNA的表達測定：取凍存主動脈組織40 mg～60 mg，提取總RNA并逆轉錄成cDNA。基因引物由上海生工生物公司設計并合成，引物序列見表1。將cDNA用RT-PCR儀進行二步法擴增，所有反應信息資料由Bio-Rad iQ5 PCR儀收集。反應體系為20 μL，包括2 μLcDNA溶液，10 μL SYBR?，每種引物1 μL(10 μmol/L)以及6 μL水。擴增條件：①95℃預變性10 min，② 95℃變性15 s，③ 60℃退火1 min，②③循環(huán)40次。GADPH管家基因作為內參對照，目的基因轉錄水平通過公式2-△△CT計算。

1.5統(tǒng)計學方法

2結果

2.1空腹血糖、糖化血紅蛋白及胰島素的變化

注射VD3前及首次注射后2、4、6周時，模型組與ATV干預組ZDF大鼠空腹血糖均顯著升高(P<0.05)，而模型組與ATV組之間差異無顯著性 (P>0.05)。在0，6周時，模型組HbA1c及血清胰島素均顯著高于正常組(P<0.05)，但ATV組與模型組之間差異無顯著性 (P>0.05)(圖1)。

表1　RT-PCR引物序列

注：與正常組相比， *P<0.05。與模型組相比， #P<0.05。 圖1　大鼠血糖、糖化血紅蛋白和血清胰島素的變化 Note. Compared with the control group, *P<0.05. Compared with the model group, *P<0.05. Fig.1　Changes of GLU, HbA1c and insulin in the rats

2.2血脂與AS指數(shù)的變化

注射VD3前及首次注射后2、4、6周時，模型組ZDF大鼠血清總CHOL、LDL-C、TG和AI均高于正常組(P<0.05)，而ATV組ZDF大鼠在首次注射VD3后第4、6周時CHOL和LDL-C水平均顯著低于模型組(P<0.05)，并在第4周時AI顯著低于模型組(P<0.05(圖2)。

2.3血清hsCRP和ox-LDL的改變

注射VD3前模型組、ATV組和正常組血清hsCRP差異無顯著性 (P>0.05)。首次注射VD3后2，4，6周時，模型組大鼠血清hsCRP水平顯著高于正常組(P<0.05)而ATV干預組血清hsCRP則顯著低于模型組(P<0.05)。首次注射VD3后第6周模型組ZDF大鼠血清ox-LDL含量高于正常組(P<0.05)，而ATV干預組ox-LDL顯著低于模型組(P<0.05)(圖3)。

2.4主動脈組織病理學觀察

觀察ZDF大鼠主動脈瓣部位AS形成情況。HE染色顯示，正常組ZL大鼠內皮平滑，無明顯增厚和炎性細胞浸潤，平滑肌排列整齊；模型組ZDF大鼠主動脈瓣根部有泡沫細胞、膽固醇晶體聚集，平滑肌細胞排列紊亂，部分有鈣化形成；而ATV干預組有少量泡沫細胞和膽固醇晶體形成。免疫組化結果顯示，正常組大鼠主動脈組織中未見巨噬細胞浸潤，模型組ZDF大鼠主動脈組織中有較多巨噬細胞浸潤，而ATV組相比于模型組主動脈組織中巨噬細胞減少(圖4，見封二)。

2.5主動脈組織NLRP3及相關炎癥因子mRNA的表達

與正常組比，模型組大鼠主動脈組織中NLRP3、caspase 1、IL-1β和TNF-α的mRNA表達顯著上調(P<0.05)；而ATV干預組則顯著下調上述基因的表達(P<0.05)。見圖5。

注：與正常組相比， *P<0.05。與模型組相比， #P<0.05。 圖2　大鼠血脂、LDL-C和AI指數(shù)的變化 Note. Compared with the control group, *P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05. Fig.2　Changes of blood CHOL, LDL-C and AI index in the rats

注：與正常組相比， *P<0.05。與模型組相比， #P<0.05。 圖3　大鼠血清hsCRP與ox-LDL的變化 Note. Compared with the control group, *P<0.05. Compared with the model group, *P<0.05. Fig.3　Changes of serum hsCRP and ox-LDL in the rats

注：與正常組相比， *P<0.05。與模型組相比， #P<0.05。 圖5　大鼠主動脈組織NLRP3與相關炎癥介質mRNA的表達 Note. Compared with the control group, *P<0.05. Compared with the model group, *P<0.05. Fig.5　Expression of NLRP3 and related inflammatory mediators mRNA in the aorta tissue of rats

3討論

AS是T2DM中常見的大血管并發(fā)癥，發(fā)病率高達70%，是導致T2DM患者死亡的主要原因[7]。目前國內外多用ZDF大鼠作為研究T2DM及相關并發(fā)癥的動物模型。ZDF大鼠因胰島β細胞基因轉錄功能缺陷而導致胰島素抵抗，在16～24周齡時，會出現(xiàn)冠狀動脈和主動脈內皮細胞功能障礙[8]。嚙齒類動物不易形成AS[9]，但用大劑量注射VD3可形成鈣超載，高鈣協(xié)同高血脂破壞動脈管壁內皮的完整性，從而有利于血漿脂質對管壁的損傷、侵入和沉積，形成AS斑塊[10]，且VD3還能夠激活機體相關炎癥信號通路[11]。因此，高脂飼喂聯(lián)合VD3注射是目前建立大鼠AS模型常用的方法[12]。本實驗通過飼喂高脂飼料加速ZDF大鼠T2DM的發(fā)病進程，并在4周后階段性注射VD3以促進AS的形成，建立早期AS模型。實驗結果顯示，ZDF大鼠高脂飼喂4周后體重、尿量、血脂、血糖、胰島素水平均顯著上升，表明出現(xiàn)典型的T2DM癥狀。此時，進行VD3注射并持續(xù)高脂飼喂，6周后模型組ZDF大鼠主動脈瓣根部內膜增厚，有泡沫細胞和巨噬細胞侵入和少量膽固醇晶體形成，部分動物出現(xiàn)鈣化斑塊，說明已形成早期的AS。

T2DM的特征癥狀為向心性肥胖，其脂肪組織被巨噬細胞浸潤，產生大量的炎癥介質。IL-1β、TNF-α等炎癥因子對胰島β細胞有毒害作用，加劇了糖尿病病癥的惡化；同時，這些炎癥因子釋放進入血液，對主動脈內皮細胞造成損傷，誘發(fā)動脈粥樣硬化斑塊的產生[13,14]。實驗顯示，模型組在注射VD3前糖尿病癥狀明顯，但血清hsCRP含量不高，炎癥反應不嚴重。自注射VD3后2周起，隨著hsCRP水平的上升、炎癥反應的加劇，動脈粥樣硬化指數(shù)也逐漸上升，呈一定的正相關性，提示T2PM中的炎癥反應是誘發(fā)動脈粥樣硬化的重要因素。給予ATV后，hsCRP水平顯著降低，AS程度有一定的減輕，說明ATV有抗炎癥反應及早期AS形成的作用。

T2DM與AS中的炎癥反應受NLRP3炎癥小體調控。NLRP3炎癥小體復合物是由成核受體蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白包含半胱天冬酶募集域(ASC)和caspase 1組成，可被多種因子激活。NLRP3的激活包括2步：首先，氧化修飾的LDL被巨噬細胞的Toll樣受體和清道夫受體識別，激活NF-κB通路，釋放TNF-α和IL-1β前體等炎癥因子。隨后，AS病變產生的膽固醇晶體和T2DM中產生的胰島淀粉樣多肽(IAPP)寡聚物被巨噬細胞吞噬，引起溶酶體破裂，釋放組織蛋白酶，組織蛋白酶可調節(jié)NLRP3的激活形成多聚體，產生成熟的IL-1β并釋放到胞外，從而使免疫細胞的聚集，引起炎癥反應和AS斑塊的形成[15]。Duewell等[16]在ApoE缺陷小鼠中發(fā)現(xiàn)，ox-LDL與CHOL能激活NLRP3炎癥小體，釋放IL-1β，促進AS的形成；Jourdan等[17]利用ZDF大鼠闡述了膽固醇晶體激活NLRP3炎癥小體，從而產生一系列的炎癥反應導致胰島細胞的死亡。本實驗觀察到，模型組ZDF大鼠血清中ox-LDL與CHOL含量顯著上升，主動脈組織中NLRP3與caspase 1基因表達上調，而NLRP3炎癥小體介導的炎癥因子IL-1β和TNF-α表達同樣上調。提示ZDF大鼠經高脂誘導后血清ox-LDL水平上升，刺激了IL-1β前體與TNF-α的產生；而TNF-α與主動脈組織中的CHOL晶體可激活NLRP3炎癥小體，上調caspase 1的表達，促進IL-1β前體成熟并釋放，加劇炎癥反應，使AS病變程度進一步加深。而ATV干預后能明顯降低ox-LDL水平并下調NLRP3及其相關炎癥基因的表達，因此，ATV可能通過降低LDL的氧化修飾反應和抑制TNF-α的產生，并減少了主動脈組織中CHOL晶體的形成，抑制NLRP3炎癥小體的激活，進而降低機體炎癥反應，減輕AS的病變程度。

綜上所述，高脂飲食聯(lián)合VD3可誘導ZDF大鼠建立T2DM并發(fā)早期AS模型；該模型中NLRP3炎癥小體及其調控的相關炎癥介質基因表達顯著上調，參與了T2DM與AS中的炎癥反應；同時ATV能抗ZDF大鼠AS的形成并降低機體的炎癥反應，可能與下調NLRP3及相關炎癥介質有關；因此，該模型可用于T2DM與AS的發(fā)病機制研究，或作為NLRP3炎癥小體靶向藥物篩選的理想動物模型。

參考文獻：

[1]潤琳, 王芳, 王懿. 2型糖尿病患者頸動脈粥樣硬化斑塊形成的危險因素分析[J]. 陜西醫(yī)學雜志, 2013, 42(10): 1358-1359.

[2]Masters SL, Latz E, O’Neill LAJ. The inflammasome in atherosclerosis and type 2 diabetes [J]. SciTransl Med, 2011, 3(81): 81ps17.

[3]毛開睿, 孫兵. NLRP3 炎癥小體研究進展 [J]. 現(xiàn)代免疫學, 2011, 31(1): 1-4.

[4]奚賽飛, 斯徐偉, 朱科燕, 等. ZDF(fa/fa)大鼠的糖脂代謝特點與胰島素抵抗特性 [J]. 實驗動物與比較醫(yī)學, 2014, 34(2): 102-106.

[5]Oltman CL, Davidson EP, Coppey LJ, et al. Vascular and neural dysfunction in Zucker diabetic fatty rats: a difficult condition to reverse [J]. Diabetes Obes Metab, 2008, 10(1): 64-74.

[6]晏沐陽, 翟永志, 劉博, 等. 高脂飲食ApoE基因敲除小鼠不同部位動脈粥樣硬化斑塊的分析比較 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2008, 18(7): 9-12.

[7]戴堯, 陳明衛(wèi), 張超學, 等. 持續(xù) 6 年胰島素強化治療對2型糖尿病患者血清炎癥因子及頸動脈內-中膜厚度影響的觀察[J]. 中國糖尿病雜志, 2014,22 (5):417-419.

[8]Chinen I, Shimabukuro M, Yamakawa K, et al. Vascular lipotoxicity: endothelial dysfunction via fatty-acid-induced reactive oxygen species over production in obese Zucker diabetic fatty rats [J]. Endocrinology, 2007, 148(1): 160-165.

[9]馬毅超, 潘永明, 陳亮, 等. 胰島素抵抗動脈粥樣硬化小型豬模型的研究 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2014, 24(1): 12-17.

[10]Zittermann A, F Gummert J, Borgermann J. The role of vitamin D in dyslipidemia and cardiovascular disease [J]. Curr Pharm Design, 2011, 17(9): 933-942.

[11]Gohil P, Solanki P. Role of vitamin D in human diseases and disorders-An overview [J]. Int J Pharmacol Res, 2014, 4(2): 34-42.

[12]李迎新，黃霖. 動脈粥樣硬化動物模型制作方法的介紹[J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2008, 18(5): 70-73.

[13]Donath MY, Shoelson SE. Type 2 diabetes as an inflammatory disease[J]. Nat Rev Immunol, 2011, 11(2): 98-107.

[14]DeFronzo RA. Insulin resistance, lipotoxicity, type 2 diabetes and atherosclerosis: the missing links. The Claude Bernard Lecture 2009[J]. Diabetologia, 2010, 53(7):1270-1287.

[15]De Nardo D, Latz E. NLRP3 inflammasomes link inflammation and metabolic disease [J]. Trends Immunol, 2011, 32(8): 373-379.

[16]Duewell P, Kono H, Rayner K J, et al. NLRP3 inflammasomes are required for atherogenesis and activated by cholesterol crystals[J]. Nature, 2010, 464(7293): 1357-1361.

[17]Jourdan T, Godlewski G, Cinar R, et al. Activation of the Nlrp3 inflammasome in infiltrating macrophages by endocannabinoids mediates beta cell loss in type 2 diabetes[J].Nat Med, 2013, 19(9): 1132-1140.

〔修回日期〕2014-11-28

更正

《中國比較醫(yī)學雜志》2014年12月第24卷第12期《LP小鼠突變基因的定位及鑒定》， 第四作者李怡單位(中文)由原來的“揚州大學比較醫(yī)學中心”變更為“南京師范大學”，特此更正。