技術(shù)方法

創(chuàng)傷較小的小鼠主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)的建立

廉洪建， 馮玄超， 啜文靜， 薛曉興， 王偉，郭淑貞

(北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京100029)

【摘要】目的探索一種對(duì)小鼠創(chuàng)傷較小的主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)的手術(shù)方法。方法 32只雄性昆明(KM)小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)10只及模型(主動(dòng)脈弓縮窄術(shù))組22只；模型組動(dòng)物麻醉后仰臥位固定，行氣管插管接通呼吸機(jī)。右側(cè)臥位重新固定，左側(cè)第二肋間開(kāi)胸，分離主動(dòng)脈弓并用5-0真絲編織線將其套扎在26G注射器針頭行縮窄操作，縮窄后退出針頭，關(guān)胸。假手術(shù)組動(dòng)物同期行開(kāi)胸，而不進(jìn)行縮窄操作，其余操作步驟與模型組相同。造模期間及造模后4周記錄動(dòng)物死亡情況；于術(shù)后4周對(duì)兩組小鼠行心臟超聲及心臟病理學(xué)檢測(cè)。結(jié)果①模型組總死亡率約為32%。②超聲心動(dòng)圖結(jié)果：模型組主動(dòng)脈弓縮窄處血流速率均大于2 400 mm/s；假手術(shù)組主動(dòng)脈弓縮窄處血流速率均小于900 mm/s。與假手術(shù)組比較，模型組左室收縮末期內(nèi)徑(LVSD)、左心室收縮期容積(LVSV)、左心室重量(LV mass, LVM)、左心室重量指數(shù)(LV mass index, LVMI)明顯增加(P<0.05)；射血分?jǐn)?shù)(EF)、左心室縮短分?jǐn)?shù)(FS)顯著降低(P<0.05)。③病理切片可見(jiàn)血管擴(kuò)張及血管壁增厚表現(xiàn)。結(jié)論本造模方法能夠成功增加心臟后負(fù)荷，誘導(dǎo)后負(fù)荷增加所致的心肌肥厚病理生理過(guò)程。與國(guó)內(nèi)報(bào)道較多的劈開(kāi)胸骨的造模方法相比，該造模方法對(duì)模型動(dòng)物的損傷更小，在與心肌肥厚病理生理機(jī)制及相關(guān)藥效研究中具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】主動(dòng)脈弓縮窄；左室肥厚；壓力超負(fù)荷；小鼠

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81102829)；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(NCET-13-0692)。

[作者簡(jiǎn)介]廉洪建(1986-)，男，碩士研究生，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治心血管疾病的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。

[通訊作者]王偉，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師；郭淑貞，女，副教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail： ss3008@126.com。

【中圖分類(lèi)號(hào)】R33【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.011

Establishment of a mouse model of transverse aortic

constriction with less invasive injury

LIAN Hong-jian, FENG Xuan-chao, CHUO Wen-jing, XUE Xiao-xing, WANG Wei, GUO Shu-zhen

(School of Basic Medical Sciences, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

Abstract【】ObjectiveTo explore a method of establishment of a mouse model of transverse aortic constriction(TAC) with less invasive injury. Methods Thirty-two male KM mice were randomly divided into two groups: sham-operation(SH) group (n=10)and transverse aortic constriction(TAC)group(n=22).Mice of the TAC group were placed in a supine position under anesthesia. The endotracheal intubation tube was then connected on a rodent ventilator.After that,the mice were replaced in the right lateral decubitus position. Thoracotomy was performed to the second rib and to separate the transverse aorta. A 26G blunt needle was inserted into thetransverse aorta, and a small piece of 5-0 silk thread was used to tightly ligate the needle inserted in the transverse aorta. The same operation was performed on the mice of sham group, except for the ligation of the transverse aorta. Then the open chest was closed and the skin was sutured. The death of mice during and post operation was recorded. Echocardiographic assessments,heart weight and histological examination of the myocardium were performed at 4 weeks after surgery.Results① The total death rate of TAC modeling was 32%. ②The blood flow velocities of the ligation of transverse aorta were all above 2400 mm/s in the TAC group，but all bellow 900 mm/s in the SH group. Compared with that in the sham operation group, the LVSD, LVDV,LVM, and LVMI were significantly increased (P<0.05), and the EF and FS were significantly decreased in the TAC group (P<0.05).③Histopathological examination showed vascular dilation and thickening of the blood vessel wall. ConclusionsThe method of establishing a mouse model of transverse aortic constriction can successfully induce pressure overload, resulting in myocardial hypertrophy and heart failure. Compared with the widely reported literature in our country, this method does not need to split the sternum and causes less invasive injury. Therefore, it may have good application value in myocardial hypertrophy-related pathophysiological and pharmacodynamics studies.

【Key words】Transverse aortic constriction;Left ventricular hypertrophy; Pressure overload; Heart; Mice

主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)( transverse aortic constriction，TAC) 所致的壓力超負(fù)荷所致的心肌肥厚模型是一種較為常用的研究心肌肥厚病理生理過(guò)程的動(dòng)物模型[1]，其常用于心血管相關(guān)藥物、分子生物學(xué)研究[2]。由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，采用小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究心血管疾病逐漸得到更多的運(yùn)用，所以小鼠主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)具有特別的意義。但由于小鼠血管細(xì)小且位置較深，手術(shù)操作難度大且容易引起出血導(dǎo)致死亡。國(guó)內(nèi)關(guān)于小鼠主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)方法文獻(xiàn)較少，其中多以前正中線劈開(kāi)胸骨后開(kāi)胸的操作方法常見(jiàn)[3, 4]。這種手術(shù)操作方法對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)傷較大。本研究介紹一種無(wú)需劈開(kāi)胸骨進(jìn)行主動(dòng)脈弓縮窄的手術(shù)方法，并通過(guò)對(duì)能夠反映心功能的超聲指標(biāo)的檢測(cè)，以驗(yàn)證該造模方法的可靠性。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：4周齡SPF級(jí)雄性昆明(KM)小鼠32只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK(京)2012-0001]；隨機(jī)分為假手術(shù)10只及主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)組22只，并于術(shù)后觀察4周。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK (京) 2011-0024。

1.1.2主要儀器：小動(dòng)物呼吸機(jī)(SAR-1000 ventilator美國(guó))、鵝頸冷光源、小鼠外科顯微手術(shù)器械、Vevo2100超聲儀(Visual Sonics加拿大)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型的制備：

1.2.1.1稱(chēng)重與麻醉：雄性昆明(KM)小鼠(25 g～30 g)稱(chēng)重，經(jīng)戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉。

1.2.1.2固定、氣管插管和機(jī)械通氣：麻醉后，用PE膠帶將小鼠四肢仰臥位粘固于自制小鼠板上，門(mén)齒用細(xì)線固定以保持氣道通暢。將固定小鼠的鼠板水平置于桌面上，頸部放置冷光源鵝頸燈照明；用壓舌板輕輕將舌牽引至口腔外，隨后將壓舌板抵住舌根輕柔向上提，可見(jiàn)冷光源照射下的咽部有明顯的圓形亮點(diǎn)即為氣管開(kāi)口；將自制氣管插管(22G靜脈套管針外鞘作為氣管插管)緩緩插入氣管，隨后接通呼吸機(jī)即可；呼吸頻率90～100次/min，潮氣量0.3～0.4 mL。(氣管插管成功時(shí)，小鼠胸廓呼吸頻率與呼吸機(jī)頻率相同，腹部無(wú)異常起伏。)成功操作氣管插管后，將小鼠重新固定為右側(cè)臥位，小鼠左側(cè)上肢方向指向頭部方向固定，以求充分暴露胸廓。

1.2.1.3開(kāi)胸:胸廓碘伏消毒，于小鼠左側(cè)第二肋間隙逐層開(kāi)胸，開(kāi)胸切口大小約為7 mm；用自制拉鉤固定切口并充分暴露胸腔內(nèi)的心、肺、胸腺、脂肪等組織；分離胸腺與脂肪以暴露主動(dòng)脈弓；用尖部磨制較細(xì)的無(wú)齒彎鑷沿胸腺與脂肪間輕輕分離，逐漸顯露隱藏在胸腺與脂肪后的主動(dòng)脈弓(該過(guò)程需輕柔、緩慢)，以便充分暴露無(wú)名動(dòng)脈與左側(cè)頸總動(dòng)脈的分叉處，右手持經(jīng)彎鑷改制的鉤狀彎鑷從無(wú)名動(dòng)脈與左側(cè)頸總動(dòng)脈的分叉處對(duì)側(cè)輕輕探入，包繞過(guò)主動(dòng)脈弓后壁，從無(wú)名動(dòng)脈與左側(cè)頸總動(dòng)脈的分叉處探出并夾持5-0真絲編織線，隨后將夾持5-0真絲編織線的鉤狀彎鑷提出使得絲線包繞過(guò)主動(dòng)脈弓；將自制的“L”形26G墊扎針置于主動(dòng)脈弓垂直上方，隨后夾持真絲編織線的兩端捆扎在該墊扎針上，打結(jié)后將墊扎針輕輕退出，剪斷結(jié)旁多余線頭，完成主動(dòng)脈弓縮窄。假手術(shù)組動(dòng)物僅行開(kāi)胸操作，而不進(jìn)行縮窄操作，其余操作步驟與模型組相同。

1.2.1.4關(guān)胸:用4-0帶線縫合針逐層關(guān)胸、縫皮。切口消毒。

1.2.1.5脫離呼吸機(jī):縫合后，進(jìn)行試驗(yàn)性脫離呼吸機(jī)而保留氣管插管。若脫機(jī)后小鼠呼吸平穩(wěn)正常，則可以完全脫機(jī)；若小鼠呼吸緩慢，可以適當(dāng)延長(zhǎng)脫機(jī)時(shí)間。

1.2.1.6術(shù)后處理及日常記錄:術(shù)后防止小鼠體溫過(guò)低要將小鼠置于電熱毯上，待其蘇醒后放入飼養(yǎng)籠中并給與飲水。記錄術(shù)中及術(shù)后兩組動(dòng)物的死亡數(shù)量，同時(shí)解剖并記錄死亡原因。

1.2.2超聲心功能評(píng)價(jià)方法及觀察指標(biāo):使用Vevo2100超聲儀(Visual Sonics加拿大)及配置的相應(yīng)探頭(MS-400型號(hào))，中心頻率30MHz,標(biāo)準(zhǔn)幀頻449fps，于術(shù)后4周行心臟超聲檢查。胸部褪毛,異氟烷呼吸麻醉,仰臥位。于主動(dòng)脈弓切面行彩色多普勒獲得其血流圖像；于左胸骨旁短軸切面，左心長(zhǎng)軸切面獲得左心室M型超聲心動(dòng)圖和左心室二維圖像。長(zhǎng)軸及短軸切面下，每一測(cè)量點(diǎn)記錄10個(gè)心動(dòng)周期;獲得左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室后壁收縮期厚度(LVPWs)、左室后壁舒張期厚度(LVPWd)、左室前壁舒張末期厚度(LVAWd)、左室前壁收縮末期厚度(LVAWs)、計(jì)算左室短軸縮短率(FS% )、左心室射血分?jǐn)?shù)(LV ejection fraction, EF%)、左心室舒張期容積(LVDV)、左心室收縮期容積(LVSV)、左心室心肌質(zhì)量(LV mass)、左心室重量(LV mass, LVM)、左心室重量指數(shù)(LV mass index, LVMI)。

1.2.3病理組織學(xué)檢測(cè):將心臟沿水平切面切取上下兩部分，下部分組織經(jīng)多聚甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包,兩組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較分析。

2結(jié)果

2.1TAC小鼠模型的存活率及并發(fā)癥

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中觀察到，主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)術(shù)中及術(shù)后死亡原因主要是主動(dòng)脈弓破裂及大血管損傷。手術(shù)操作過(guò)程中及術(shù)后24 h模型組死亡4只，成活18只，術(shù)后存活率約為82%；術(shù)后4周模型組總計(jì)死亡7只，存活15只，模型組存活率約為68%。術(shù)后4周假手術(shù)組共計(jì)死亡0只，存活10只；

2.2超聲結(jié)果

術(shù)后4周，主動(dòng)脈弓切面下，模型組動(dòng)物無(wú)名動(dòng)脈與左側(cè)頸總動(dòng)脈間可見(jiàn)縮窄線；主動(dòng)脈弓縮窄處血流速率超過(guò)2 400 mm/s；假手術(shù)組血流速率均低于900 mm/s。結(jié)果表明該手術(shù)模型能夠顯著增加心臟后負(fù)荷。術(shù)后4周模型組與假手術(shù)組比較：左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左心室收縮期容積(LV Vol;s)、左心室重量(LV mass, LVM)、左心室重量指數(shù)(LV mass index, LVMI)明顯增加(P<0.05)；射血分?jǐn)?shù)(EF)、左心室縮短分?jǐn)?shù)(FS)顯著降低(P<0.05)。結(jié)果表明：模型組動(dòng)物心臟重量增加、順應(yīng)性降低，心功能有所下降。左室后壁收縮期厚度(LVPWs)、左室前壁舒張末期厚度(LVAWd)、左室前壁收縮末期厚度(LVAWs) 差異無(wú)明顯意義(表1)；

2.3組織形態(tài)學(xué)結(jié)果

術(shù)后4周，模型組與假手術(shù)組相比，動(dòng)脈血管管腔變大，血管壁增厚，血管壁外側(cè)結(jié)締組織增生，向附近心肌組織滲透。心肌細(xì)胞較為肥大，心肌纖維束增寛，心肌纖維外的成纖維細(xì)胞增多；假手術(shù)組，心肌細(xì)胞無(wú)肥大，心肌纖維外的成纖維細(xì)胞無(wú)異常增多；動(dòng)脈無(wú)擴(kuò)張及血管壁增厚表現(xiàn)(圖1,見(jiàn)封二)。

3討論

主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)小鼠模型是還原壓力超負(fù)荷導(dǎo)致心肌代償性肥大到失代償性心衰病理生理發(fā)展過(guò)程的理想模型，造模過(guò)程略微復(fù)雜，但病變程度可控，模型穩(wěn)定、重復(fù)性好。

表1　術(shù)后4周心臟彩超指標(biāo)變化(-x±s)

注: 模型組與假手術(shù)組比較，*P<0.05；

Note. TAC group vs.sham-operation group*P<0.05.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，模型組動(dòng)物主動(dòng)脈弓縮窄處血流速率超過(guò)2 400 mm/s；假手術(shù)組血流速率均低于900 mm/s。結(jié)果表明該手術(shù)模型已經(jīng)成功的引起了心臟后負(fù)荷的增加。國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，嚴(yán)重的主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)后3 d即可出現(xiàn)左室肥厚[5]，其心肌肥厚的進(jìn)展速度與縮窄的嚴(yán)重程度有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后4周模型組超聲結(jié)果左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左心室收縮期容積(LVDV)、左心室重量(LV mass, LVM)、左心室重量指數(shù)(LV mass index, LVMI)均明顯增加，提示了心臟重量增加，心功能有所下降，符合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。模型組動(dòng)物組織形態(tài)學(xué)可見(jiàn)血管和心肌細(xì)胞的病理變化，包括血管管腔變大，血管壁增厚，血管壁外側(cè)結(jié)締組織增生，并向附近心肌組織滲透；心肌細(xì)胞肥大，心肌纖維束增寛，心肌纖維外的成纖維細(xì)胞增多等表現(xiàn)。其表現(xiàn)均屬心肌肥厚的病變表現(xiàn)，進(jìn)一步證實(shí)該方法能夠可靠的增加心臟后負(fù)荷，并誘導(dǎo)心肌肥厚的發(fā)生。

根據(jù)筆者實(shí)驗(yàn)中的體會(huì)，該造模方法中應(yīng)當(dāng)重點(diǎn)注意以下操作步驟：(1)若遇到特殊情況，氣管插管3次不成功時(shí)，不可繼續(xù)嘗試，防止術(shù)后喉頭水腫導(dǎo)致窒息死亡。(2)開(kāi)胸階段避免損傷乳內(nèi)動(dòng)脈引起大失血。(3)分離主動(dòng)脈弓及穿線時(shí)，動(dòng)作務(wù)必輕柔緩慢，防止器械劃傷大血管及重要組織。(4)在縮窄點(diǎn)行縮窄操作時(shí)，結(jié)扎力度應(yīng)松緊適當(dāng)，力度過(guò)緊容易導(dǎo)致主動(dòng)脈弓破裂出血。(5)關(guān)胸縫合時(shí)，避免損傷肺臟、大血管等。

本造模方法與國(guó)內(nèi)多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的劈開(kāi)胸骨后行縮窄術(shù)的方法不同，其術(shù)后存活率雖與國(guó)內(nèi)報(bào)道的其他手術(shù)方法存活率相當(dāng)[6]，但該方法無(wú)需劈開(kāi)胸骨進(jìn)入胸腔，而僅是將小鼠右側(cè)臥位以左側(cè)第二肋間隙直接開(kāi)胸，從而極大的減少了對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物骨骼及胸腺等部位組織的損傷。除此之外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后體能恢復(fù)很快，術(shù)后蘇醒后即可自由活動(dòng)，飲食飲水，無(wú)需實(shí)驗(yàn)人員特殊護(hù)理，不會(huì)增加實(shí)驗(yàn)人員的工作量。該造模方法尚具有操作步驟簡(jiǎn)單、操作時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，在與心肌肥厚病理生理機(jī)制及相關(guān)藥效研究中具有很大的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hu P, Zhang D, Swenson L, et al. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2003,285(3):H1261-1269.

[2]Moore XL, Tan SL, Lo CY, et al. Relaxin antagonizes hypertrophy and apoptosis in neonatal rat cardiomyocytes [J]. Endocrinology，2007,148(4):1582-1589.

[3]李曉梅, 馬依彤, 楊毅寧, 等. 小鼠主動(dòng)脈弓縮窄模型的建立及評(píng)價(jià) [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，(11):24-9, 86.

[4]張煥基, 黃輝, 張坤, 等. 無(wú)呼吸機(jī)支持下小鼠主動(dòng)脈弓縮窄模型優(yōu)化法評(píng)價(jià) [J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2013，(05):19-22.

[5]Liao Y, Ishikura F, Beppu S, et al. Echocardiographic assessment of LV hypertrophy and function in aortic-banded mice: necropsy validation [J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol，2002,282(5):H1703-1708.

[6]李曉梅, 馬依彤, 楊毅寧, 等. 不同品系小鼠主動(dòng)脈弓縮窄壓力負(fù)荷模型的比較 [J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)， 2008，(04):209-214.

〔修回日期〕2014-11-15