研究報告

四物湯干預減輕乙醇對小鼠肝臟的損傷作用

白云峰1，李曉娟2，李永綱1，王立福1，李蓓2，王睿林1，李瑞生2

(1. 解放軍第302醫(yī)院中西醫(yī)結合肝病診療與研究中心，北京100039；

2. 解放軍第302醫(yī)院實驗技術研究保障中心，北京100039)

【摘要】目的通過四物湯對小鼠酒精性肝損傷的干預效果的研究，闡明其對乙醇損傷肝臟的影響，為四物湯臨床防治酒精性肝病提供實驗數(shù)據(jù)。方法選擇60只C57小鼠，隨機分為對照組、模型組和四物湯低、中、高劑量(0.91、1.82、3.64 g/kg/d)組，每組12只，用50%乙醇灌胃建立酒精性脂肪肝模型，同時用四物湯進行干預。實驗6周后，對各組小鼠的體質量、肝指數(shù)、血清生化指標和肝臟病理學改變進行綜合對比分析。結果四物湯各劑量組小鼠與模型組相比其體重增長量均顯著增加(P<0.05)，肝指數(shù)明顯降低(P<0.05)，血清ALT、AST和TG含量(P<0.05)均顯著降低。四物湯從低到高劑量組的肝臟外觀從粗糙逐漸變光滑，顏色逐漸加深。病理結果也顯示肝臟脂肪變隨著劑量從低到高呈遞減的程度，而高劑量組小鼠的脂肪變改善效果最顯著。結論四物湯對小鼠酒精性肝損傷具有一定的保護作用。

【關鍵詞】四物湯；乙醇； 肝臟損傷

[基金項目]解放軍第302醫(yī)院院長創(chuàng)新基金：YNKT2013026。

[作者簡介]白云峰(1970-)，男，博士，E-mail： yunfengbai3@yahoo.com.cn；李曉娟(1980-)，女，碩士，E-mail： sxlily55@163.com。并列第一作者。

[通訊作者]李瑞生(1969-)，男，博士，副研究員，從事人類疾病動物模型研究，E-mail： lrsheng@sohu.com；王睿林(1979-)，男，博士，主治醫(yī)師，從事中西醫(yī)結合治療研究，E-mail： wrl7905@163.com。

【中圖分類號】R33【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.003

Protective effect of Siwu decoction on alcoholic hepatic injury in mice

BAI Yun-feng1，LI Xiao-juan2，LI Yong-gang1，WANG Li-fu1，LI Bei2，WANG Rui-lin1，LI Rui-sheng2

(1. Liver Disease Center of Combined TCM and Western Medicine，

2. Research and Technology Service Center, 302 Hospital of PLA, Beijing 100039，China)

Abstract【】ObjectiveTo provide experimental data for clinical prevention and treatment of alcoholic liver disease in mice by a Chinese medicine, Siwu decoction, and study the intervention effect of Siwu decoction on alcoholic liver injury. MethodsSixty C57 mice were selected and randomly divided into the control group，model group and Siwu decoction low, medium and high dose (0.91, 1.82, 3.64 g/kg/d) groups, 12 mice in each group. The mouse models of alcoholic fatty liver were generated with gastric gavage of 50% ethanol, and Siwu decoction intervention was applied to these mouse models. Six weeks later，the mice body weight，liver index，serum biochemical indexes and liver pathological changes were determined and analyzed. ResultsCompared with the model group, Body weight gains of mice in all dose Siwu Decoction groups were significantly increased (P<0.05)，and liver indexes significantly decreased (P<0.05). The serum levels of ALT, AST and TG content significantly decreased(P< 0.05)．The liver gross appearance was gradually changed from rough to smooth and the color gradually deepened in the mice of Siwu decoction groups, increasingly from low to high dose group．Pathological examination showed a decrease of hepatic steatosis in the mice treated with Siwu decoction from low dose to high dose, and mice in the high dose group showed the best improvement of hepatic steatosis. Conclusion The Chinese medicine Siwu decoction has a protective effect on alcoholic liver injury in mice.

【Key words】Siwu decoction; Ethanol; Liver damage

酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是由于長期大量飲酒所導致的肝臟疾病，由于嗜酒已成為當今世界日益嚴重的公共衛(wèi)生問題，因此酒精性肝病的研究也成為全球的研究熱點[1]。乙醇進入體內(nèi)會經(jīng)過多種途徑對肝臟造成損傷[2]，其中由乙醇引起氧化應激所產(chǎn)生的自由基可使線粒體膜通透性增加[3]，引起細胞能量代謝障礙而導致肝細胞損傷。而中藥四物湯由白芍、當歸、川芎和地黃組成，這四種中藥均歸經(jīng)入肝，具有補血養(yǎng)肝，行瘀破滯之功[4]，近年來還報道四物湯具有增強血清超氧化物歧化酶活力，促進自由基消除的作用[5]。因此為了探討四物湯是否對小鼠酒精性肝損傷過程具有干預作用，本實驗選取近交系C57小鼠[6]，通過觀察四物湯對急性酒精性肝損傷試驗動物體質量、肝指數(shù)和肝細胞脂肪變性等的影響，分析其對急性酒精性肝損傷的防護作用及作用機理，以期為探尋ALD臨床治療藥物奠定實驗數(shù)據(jù)。

1材料和方法

1.1實驗動物

選擇SPF級C57雄性小鼠60只，單鼠體質量為20 g～22 g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，生產(chǎn)許可證【SCXK(軍)2012-0004】，實驗在本實驗室SPF級中進行，使用許可證【SYXK(軍)2012-0010】。

1.2試劑及飼料

四物湯顆粒由302醫(yī)院藥劑室制備(3 g/袋)；乙醇(分析純，純度>99.7%)(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20130315)；生理鹽水(解放軍第302醫(yī)院制劑室提供，批號：130527405，石家莊四藥有限公司)。

1.3動物分組及實驗方法

健康雄性C57小鼠60只，適應性喂養(yǎng)5 d后，隨機分為5個組，分別為正常對照組、模型組、四物湯顆粒高劑量組(3.64 g/kg)、中劑量組(1.82 g/kg)、低劑量組(0.91 g/kg)，每組各12只。四物湯的劑量根據(jù)人臨床劑量換算，換算公式：小鼠劑量(g/kg)=9.1 × 人臨床劑量(0.1 g/kg)。此劑量作為低劑量，中劑量與高劑量分別為低劑量的2倍和4倍。每日正常組和模型組灌胃生理鹽水，實驗組灌胃不同劑量的四物湯，灌完間隔30 min后[7]，正常組繼續(xù)用生理鹽水灌胃，其余各組小鼠每日給予濃度50%乙醇灌胃，灌胃量為12 mL/(kg體重)[8]，持續(xù)6周。小鼠每周稱重1次，按體重調(diào)整四物湯、乙醇灌胃量。實驗期間小鼠均可自由進食和飲水。

1.4觀察指標及檢測方法

實驗過程中每天觀察各組小鼠精神狀態(tài)，于實驗結束前1 d禁食12 h，次日稱重后經(jīng)小鼠眶后靜脈叢采血，離心取血清，檢測各組小鼠血清生化指標：天冬氨酸轉氨酶(AST)、丙氨酸轉氨酶(ALT)和甘油三酯(TG)。取血后迅速取各組小鼠肝臟組織，稱取肝臟重量，按公式計算：肝指數(shù)=肝質量(g)/體質量(g) × 100%；然后采集所有小鼠相同部位的肝組織用甲醛固定進行HE染色，在光學顯微鏡下觀察分析各組小鼠肝臟的組織病理學結果。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，各組間采用方差分析進行比較，以P<0.05顯示差異是否有顯著性。

2結果

2.1各組小鼠體重增長量及生化指標的分析

通過對各組小鼠體重增長量、肝指數(shù)和生化指標的對比分析顯示：與對照組比較，模型組小鼠的體重增長量顯著降低(P<0.05)，肝指數(shù)顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，四物湯各劑量組小鼠的體重增長量均顯著增加(P<0.05)，肝指數(shù)明顯降低(P<0.05)。與對照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST和TG顯著增高(P<0.05)；而與模型組比較，四物湯各劑量組血清ALT、AST和TG含量明顯降低(P<0.05)，其中四物湯對AST和TG含量的影響呈現(xiàn)出劑量依賴性(表1)。

表1　各組小鼠體質量、肝指數(shù)和生化指標分析

注：與對照組比較 *P<0.05，與模型組比較△P<0.05。

Note.*P<0.05, compared with the control group；△P<0.05, compared with the model group.

2.2各組小鼠肝臟外觀的分析

肝臟外觀標本顯示：對照組小鼠肝臟被膜光滑，呈紅褐色，質地柔軟；模型組小鼠肝臟邊緣呈圓鈍狀，色澤呈淡紅色，質地較粗糙。四物湯各劑量組肝臟外觀均較模型組肝臟顏色呈暗紅色，而且從低劑量組至高劑量組肝臟顏色逐漸加深，肝臟外觀從粗糙逐漸變光滑，其結果見圖1(圖1見文后彩插2)。

2.3各組小鼠肝組織病理學的分析

肝臟病理學研究結果顯示：對照組小鼠肝小葉結構清晰，肝索排列規(guī)則且以中心靜脈放射排列，匯管區(qū)未見炎癥細胞浸潤。模型組小鼠肝細胞明顯腫脹，肝小葉界限模糊，肝細胞內(nèi)有成堆的脂肪滴，已呈現(xiàn)典型的酒精性脂肪肝病變。與模型組比較，四物湯低劑量組和中劑量組的脂肪變程度均有所改善，而高劑量組小鼠肝細胞腫脹減輕，少數(shù)肝細胞輕度水腫，肝小葉及匯管區(qū)未見炎性細胞浸潤，脂肪變程度明顯減輕(圖2，圖2見文后彩插2)。

3討論

酒精過量引起的肝損傷已經(jīng)成為嚴重的世界性公共衛(wèi)生問題。酒精性肝病的發(fā)生與乙醇及其代謝產(chǎn)物的直接毒性、營養(yǎng)改變、脂質過氧化及遺傳免疫因素等有關[9]，目前臨床上仍以戒酒為主要的治療手段，至今仍未找到有效的治療靶點和方法，故尋找有效預防及延緩酒精性肝病發(fā)展的理想藥物尤為重要[10]。近年來各類中藥材以及從各類藥學植物中提取的有效成分應用于酒精性肝病治療逐漸成為研究熱點。于海玲等[11]證實了由人參、川芎、白芍、胡桃仁及鴨肉等制備而成的肝康顆粒通過減輕酒精對肝臟的脂質過氧化損傷，從而抑制酒精的肝毒性反應；付斌等[12]也證實了由靈芝、葛根、枳椇子、枸杞子為原料的護肝片能夠減輕酒精對肝細胞的損傷；劉超群等[13]將大蒜中提取的大蒜多糖應用于酒精性肝損傷的治療也得到了有效的結果。眾所周知，四物湯是中醫(yī)臨床具有活血化瘀作用的基礎方，常用于治療可見血瘀證候的多種疾病。最新研究表明其具有消除自由基的作用[5]，而自由基在酒精性肝損傷的發(fā)病過程中起到關鍵的作用。但至今尚未見四物湯應用于酒精性脂肪肝治療的報道。臨床觀察發(fā)現(xiàn)酒精性脂肪肝中醫(yī)證候類型之“血瘀證”是其主要的證型，治療可以四物湯為基礎方以活血化瘀。

因此本實驗應用四物湯對酒精中毒小鼠干預6周后，對各組小鼠體重增長量和肝指數(shù)結果分析顯示：模型組小鼠體重增長量顯著降低(P<0.05)，肝指數(shù)顯著增加(P<0.05)，表明長期飲酒會降低小鼠食欲和對食物的吸收能力，同時肝臟組織存在受損腫脹情況。而四物湯各組結果與模型組相比較，小鼠體重增長量顯著增加(P<0.05)，肝指數(shù)顯著降低(P<0.05)，說明四物湯具有改善酒精中毒小鼠的食欲和吸收功能的作用，對肝臟腫脹情況有所改善。血清ALT和AST活性升高為肝細胞損傷的特異性指標，只要有1%的肝細胞壞死，便可使血中酶活性增高1倍。而肝臟病理學檢查則被認為是判斷肝臟損傷的金標準[14]。模型組小鼠血清中ALT、AST和TG與對照組比較均顯著增高(P<0.05)；而四物湯各劑量組血清ALT、AST和TG含量與模型組比較均顯著降低(P<0.05)，提示四物湯具有較強的抗酒精性肝臟損傷的效應。肝臟外觀和肝臟病理學結果顯示：四物湯從低劑量到高劑量對酒精性肝損傷有遞增的改善作用，也說明四物湯對酒精性肝損傷出現(xiàn)的脂肪變性和炎癥病理學改變具有抑制和減緩發(fā)展的作用。因此初步推斷四物湯可能是通過改善微循環(huán)消除自由基而發(fā)揮抗酒精性肝損傷的效應，而作用機制還有待進一步深入研究。

總之，本實驗應用四物湯干預小鼠酒精性肝損傷，表明四物湯具有抑制和減緩肝細胞脂肪變性、減輕炎癥和修復肝臟細胞的作用，對乙醇誘導的小鼠酒精性肝損傷具有顯著的保護作用，為ALD發(fā)病機制和臨床治療藥物的研發(fā)開辟了新的實驗平臺。

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〔修回日期〕2014-10-20

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