研究報(bào)告

睪酮缺乏對(duì)高脂飲食小型豬血脂和肝內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響

蔡兆偉，潘永明，陳亮，朱科燕，陳方明，蔡月琴，徐孝平，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州310053)

【摘要】目的探討睪酮缺乏對(duì)高脂飲食小型豬血脂水平和肝臟脂質(zhì)沉積的影響。方法取6~7月齡性成熟后的雄性五指山小型豬18只按體重隨機(jī)分成三組，即不去勢(shì)組，去勢(shì)組和去勢(shì)加睪酮處理組，每組6只。三組動(dòng)物均采用高脂飼料飼喂12周，每周測(cè)定動(dòng)物體重。采血檢測(cè)血清睪酮、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和甘油三酯(TG)水平變化。12周后動(dòng)物處死，采集肝組織，檢測(cè)肝臟TG和TC含量。肝組織標(biāo)本石蠟包埋切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，觀察肝臟病理變化。 結(jié)果 (1)高脂飲食誘導(dǎo)后，三組小型豬體重均呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)，不去勢(shì)和去勢(shì)加睪酮處理組小型豬的體重略高于去勢(shì)組小型豬，但三者差異不顯著；(2)去勢(shì)小型豬血清睪酮含量顯著減少，但給予外源性睪酮后，睪酮水平恢復(fù)；(3)去勢(shì)顯著增加高脂飲食小型豬血清TC，LDL-C和TG水平，但對(duì)血清HDL-C水平?jīng)]有顯著影響。睪酮處理后，血清TG，TC和LDL-C水平均顯著降低；(4)去勢(shì)組小型豬肝臟TG和TC含量均顯著高于不去勢(shì)組小型豬，睪酮處理后TG和TC含量顯著減少；(5)與不去勢(shì)組小型豬相比，去勢(shì)組小型豬肝細(xì)胞脂肪變性程度增加，睪酮處理后，去勢(shì)小型豬肝脂肪變性程度明顯減輕。結(jié)論睪酮缺乏加劇高脂飲食誘導(dǎo)小型豬的血脂代謝紊亂，增加肝臟脂質(zhì)沉積。

【關(guān)鍵詞】睪酮；小型豬；動(dòng)脈粥樣硬化；高膽固醇血癥

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)

[作者簡(jiǎn)介]蔡兆偉(1983-)，男，助理研究員，研究方向?yàn)閯?dòng)物分子遺傳。E-mail: czw1234@163.com。

[通訊作者]陳民利(1963-)，女，教授，研究方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: cml991@126.com。

【中圖分類號(hào)】R332【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.007

Effects of testosterone deficiency on serum lipid levels and hepatic lipid

accumulation in miniature pigs fed a high-fat diet

CAI Zhao-wei，PAN Yong-ming，CHEN Liang，ZHU Ke-yan，CHEN Fang-ming，CAI Yue-qin，XU Xiao-ping，CHEN Min-li

(Laboratory Animal Research Center/Comparative Medical Research Center,

Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Abstract【】ObjectiveThe aim of this study was to explore the effect of testosterone deficiency on serum lipid levels and hepatic lipid accumulation in miniature pigs fed a high-fat diet (HFD). Methods Eighteen sexually mature male Chinese Wuzhishan miniature pigs (6~7 months old) were used in this study. The pigs were divided in three groups (n=6 animals/group) as follows: intact male pigs, castrated male pigs and castrated male pigs with testosterone replacement. They were fed a HFD diet for 12 weeks and body weights were recorded weekly. Serum levels of testosterone, total cholesterol (TC), high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and triglycerides (TG) were measured. Hepatic TG and TC levels were also determined, and liver tissues were embedded in paraffin and stained with hematoxylin and eosin (H&E). Results(1) The body weights of pigs in each group were found to be linearly elevated over time. Though castrated pigs gained less weight than did pigs in the other groups, no significant differences were found between them. (2) Castration caused a significant decrease in serum testosterone levels in pigs. This effect was recovered by testosterone treatment. (3) Serum levels of TC, LDL-C and TG were significantly increased in castrated pigs. However, castration had no significant effect on serum HDL-C levels. Testosterone treatment reduced the increased serum lipids in castrated pigs. (4) Hepatic TG and TC contents in castrated pigs were also significantly higher than those in other groups of pigs. Testosterone treatment reduced the increased hepatic lipids in castrated pigs. (5) Compared with other groups of pigs, castrated pigs showed increased steatosis. However, testosterone treatment attenuated hepatic steatosis in castrated pigs. Conclusion Testosterone deficiency caused severe dyslipidemia, and increased hepatic lipid accumulation in miniature pigs fed a high-fat diet.

【Key words】Testosterone; Miniature pigs; Atherosclerosis; Hypercholesterolemia

近年來(lái)研究表明，雄激素(主要是睪酮)缺乏加速男性動(dòng)脈粥樣硬化形成[1-4]，但具體影響機(jī)制尚不完全清楚。血脂異常，尤其是血膽固醇水平升高是動(dòng)脈粥樣硬化的主要發(fā)病因素[3]。流行病學(xué)研究顯示，男性隨著年齡的增加，體內(nèi)睪酮水平逐漸降低，而血漿TC、LDL-C和TG水平顯著升高[2,4]，提示內(nèi)源性睪酮缺乏會(huì)引起血脂代謝紊亂，可能影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成。豬的心血管系統(tǒng)在解剖結(jié)構(gòu)、 生理功能方面與人類極為相似，尤其是脂蛋白結(jié)構(gòu)與組成、脂質(zhì)代謝機(jī)制與人類最為接近，是研究脂代謝和動(dòng)脈粥樣硬化的理想模式動(dòng)物[5]。盡管目前睪酮影響血脂代謝的研究較多，但以豬為模型的有關(guān)睪酮調(diào)節(jié)高脂飲食誘導(dǎo)的血脂代謝紊亂的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)建立睪酮調(diào)控高脂飲食小型豬血脂代謝的動(dòng)物模型，分析去勢(shì)和睪酮處理對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小型豬血脂水平以及肝臟脂質(zhì)沉積的影響，旨在為今后防治雄激素缺乏引起的男性動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～7月齡性成熟后的雄性五指山小型豬18只，體重為10～12 kg，來(lái)源于廣東大華動(dòng)物保健品股份有限公司提供【SCXK(粵)2008-0022】，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心普通級(jí)小型豬實(shí)驗(yàn)室【SYXK(浙)2013-0183】，環(huán)境溫度：22±1℃，相對(duì)濕度：40% ～ 65%，自由飲水，12h/12h明暗交替。并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2儀器與試劑

日立7020型全自動(dòng)生化儀(日本日立公司)；Nikon eclipase 80i倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；自動(dòng)染色機(jī)(德國(guó)Leica公司)；丙酸睪酮注射液(50 mg/mL)購(gòu)自上海通用藥業(yè)股份有限公司；總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和甘油三酯(TG)試劑盒購(gòu)自上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司；蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；豬睪酮ELISA試劑盒購(gòu)自上海拜沃生物科技有限公司。

1.3動(dòng)物分組及高脂飲食誘導(dǎo)

小型豬適應(yīng)性恢復(fù)4周后，按體重隨機(jī)分成三組，即非去勢(shì)組，去勢(shì)組，去勢(shì)加睪酮處理組，每組6只。小型豬去勢(shì)之前，頸靜脈采血檢測(cè)性激素和血脂代謝情況是否正常。去勢(shì)手術(shù)在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行，肌肉注射鎮(zhèn)靜劑(氯胺酮：2.5 mg/kg)以后，在麻醉(異氟烷：1.5%～2.0%)狀態(tài)下，將小型豬陰囊處切口后將睪丸去除；非去勢(shì)組小型豬進(jìn)行偽去勢(shì)處理，即將陰囊處進(jìn)行切口，但不去除睪丸[6]。為了避免雄激素影響的中斷，去勢(shì)睪酮處理組小型豬將小型豬去勢(shì)以后，隨后注射丙酸睪酮注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司，10 mg/kg 體重)，具體方法參照文獻(xiàn)[7]。手術(shù)一周后，三組動(dòng)物均采用高脂飼料飼喂12周，高脂飼料配方：1.5%膽固醇、10%蛋黃粉、0.5% 食鹽、15%起酥油、73%基礎(chǔ)飼料。高脂飼料中主要營(yíng)養(yǎng)成分百分比：蛋白質(zhì)15.86%，碳水化合物40.82%，脂肪25.12%；每克飼料含熱量4.45 kcal。

1.4血清睪酮和血脂指標(biāo)檢測(cè)

分別在實(shí)驗(yàn)前0周和實(shí)驗(yàn)后4、8、12周時(shí)，禁食12 h后，取頸靜脈血5 mL，3000 r/min離心15 min，分離血清。采用ELISA試劑盒檢測(cè)12周小型豬血清中睪酮含量；采用全自動(dòng)生化分析儀酶聯(lián)免疫法檢測(cè)血清中血脂指標(biāo)包括總膽固醇(TC)、低高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和甘油三酯(TG)水平變化，具體方法按照試劑盒的操作說(shuō)明使用(上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司)。

1.5肝臟組織甘油三酯和膽固醇含量測(cè)定

稱取500 mg左右肝臟組織，加入9倍體積的預(yù)冷生理鹽水，置于玻璃勻漿管中充分研磨制成勻漿液，勻漿后在4℃條件下3000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定肝臟中TG和TC含量，具體方法按照試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書使用(上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司)。肝臟蛋白含量采用BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定，具體步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)。

1.6肝臟組織病理學(xué)觀察

取小型豬肝臟組織置于10%中性甲醛溶液固定后，常規(guī)脫水石蠟包埋后，切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色和中性樹(shù)膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，并采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One way-ANOVA)分析，組間多重比較采用Tukey方法進(jìn)行分析，以P< 0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

注：A：體重；B：血清睪酮. ** P <0.01. 不去勢(shì)(假手術(shù))：SHAM；去勢(shì)：CAS；去勢(shì)+睪酮：CAS+T。 圖1　去勢(shì)和睪酮處理對(duì)高脂飲食小型豬體重和血清睪酮水平的影響 Note：A: Body weight; B; Serum testosterone levels. ** P <0.01. Sham-operated: SHAM; Castration: CAS; Castration with testosterone supplementation: CAS+T. Fig.1　Effects of castration and testosterone replacement on body weight and serum testosterone levels in miniature pigs fed a high-fat diet

2結(jié)果

2.1去勢(shì)和睪酮處理對(duì)高脂飲食小型豬體重和血清睪酮含量的影響

去勢(shì)和睪酮處理對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小型豬體重和血清睪酮水平的影響見(jiàn)圖1。三組小型豬飼喂高脂飼料后，體重均呈線性增長(zhǎng)趨勢(shì)。去勢(shì)組小型豬體重增長(zhǎng)速度慢于不去勢(shì)和去勢(shì)加睪酮處理組小型豬，但三組小型豬體重之間差異不顯著(P>0.05)(圖1A)。由圖可見(jiàn)，小型豬去勢(shì)后，血清睪酮水平顯著降低(P<0.01)，采用外源性睪酮處理后，血清睪酮水平則顯著升高(P<0.01)(圖1B)。

2.2去勢(shì)和睪酮處理對(duì)高脂飲食小型豬血脂水平的影響

為研究去勢(shì)和睪酮處理對(duì)高脂誘導(dǎo)小型豬血脂代謝的影響，我們檢測(cè)了三組小型豬0、4、8和12周時(shí)血脂代謝指標(biāo)的變化(圖2)。由圖可見(jiàn)，飼喂高脂飼料后，三組小型豬血清TC，HDL-C，LDL-C以及TG水平均顯著升高。高脂誘導(dǎo)4、8和12周時(shí)，去勢(shì)組小型豬血清TC水平均顯著高于不去勢(shì)組小型豬(P<0.01)；采用睪酮處理后，去勢(shì)加睪酮處理組小型豬TC水平顯著降低(P<0.01)(圖2A)。去勢(shì)和睪酮處理對(duì)高脂飲食小型豬HDL-C水平?jīng)]有顯著影響(P>0.05)(圖2B)。小型豬血清LDL-C水平變化趨勢(shì)與TC相似，去勢(shì)小型豬血清LDL-C水平均顯著高于其他兩組小型豬(P<0.01)(圖2C)。12周時(shí)，去勢(shì)組小型豬血清TG水平顯著高于不去勢(shì)組(P<0.01)和去勢(shì)加睪酮處理組(P<0.05)小型豬(圖2D)。

2.3去勢(shì)和睪酮處理對(duì)高脂飲食小型豬肝臟組織病理變化的影響

高脂飲食誘導(dǎo)12周后，三組小型豬肝組織均發(fā)生不同程度的脂肪變性(彩插5圖3)。由圖可見(jiàn)，相比不去勢(shì)組小型豬，去勢(shì)組小型豬肝臟脂肪變性程度顯著增加，并且發(fā)生大量的大泡性和小泡性脂肪變性，而不去勢(shì)組小型豬則只有少量小泡性脂肪變性。采用睪酮處理后，小型豬肝臟脂肪變性程度則明顯有所改善(彩插5圖3)。

2.4去勢(shì)和睪酮處理對(duì)高脂飲食小型豬肝臟脂質(zhì)沉積的影響

去勢(shì)和睪酮處理對(duì)高脂飲食小型豬肝臟TG和TC含量的影響見(jiàn)圖4。去勢(shì)組小型豬肝臟TG含量顯著高于不去勢(shì)組小型豬(P<0.05)，采用睪酮處理后，去勢(shì)小型豬肝臟TG含量則顯著減少(P<0.01)(圖4)。與TG相似，去勢(shì)組小型豬肝臟TC含量顯著高于不去勢(shì)小型豬和去勢(shì)加睪酮處理組小型豬(P<0.05)(圖4)。

注：A：總膽固醇；B：高密度脂蛋白膽固醇。C：低密度脂蛋白膽固醇；D.甘油三酯。不去勢(shì)(假手術(shù))：SHAM；去勢(shì)：CAS； 去勢(shì)+睪酮：CAS+T. 不去勢(shì)組與去勢(shì)組相比， * P <0.05； ** P <0.01。去勢(shì)+睪酮組與去勢(shì)組相比， #P <0.05； ##P <0.01。 圖2　去勢(shì)和睪酮處理對(duì)高脂飲食小型豬血脂水平的影響 Note：A: TC; B: HDL-C; C: LDL-C; D: TG. Sham-operated: SHAM; Castration: CAS; Castration with testosterone supplementation: CAS+T. * P <0.05 and ** P <0.01,SHAM vs. CAS; # P <0.05 and ## P <0.01, CAS+T vs. CAS. Fig.2　Effects of castration and testosterone treatment on serum lipid levels in miniature pigs fed a high-fat diet

注：A：肝臟甘油三酯含量；B：肝臟膽固醇含量. 不去勢(shì)(假手術(shù))：SHAM；去勢(shì)：CAS； 去勢(shì)+睪酮：CAS+T. * P <0.05， ** P <0.01。 圖4　去勢(shì)和睪酮處理對(duì)高脂飲食小型豬肝臟甘油三酯和膽固醇含量的影響 Note：A: Hepatic TG contents; B: Hepatic TC contents. Sham-operated: SHAM; Castration: CAS; Castration with testosterone supplementation: CAS+T. * P <0.05, ** P <0.01. Fig.4　Effects of castration and testosterone treatment on hepatic TG and TC contents in miniature pigs fed a high-fat diet

3討論

大量研究表明，低雄激素(主要是睪酮)水平增加男性患動(dòng)脈粥樣硬化疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1-4]。目前研究認(rèn)為，睪酮缺乏引起血脂代謝紊亂，最終會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能紊亂和促炎性細(xì)胞因子增加，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化形成[3]，其機(jī)制包括受體依賴性和非依賴性(芳香化)介導(dǎo)的途徑[8]。但雄激素水平變化與血脂代謝之間的關(guān)系，不同的研究得出的結(jié)果也不盡相同。有研究表明，大鼠去勢(shì)后，血漿TC水平顯著增加，但TG水平?jīng)]有明顯變化[9]。相比不去勢(shì)雄鼠和雌鼠，去勢(shì)雄鼠血清TC和TG水平都顯著增高[10]。還有研究發(fā)現(xiàn)，去勢(shì)對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠血清TC水平?jīng)]有影響，卻減少血清TG水平[11]。另外，去勢(shì)可顯著增加高脂飲食誘導(dǎo)的雄兔血清TC、LDL-C和TG水平[12]。目前睪酮影響血脂水平的研究采用的動(dòng)物多為大鼠、小鼠和兔等，但它們的血脂代謝與人類存在較大差異，并且動(dòng)脈粥樣硬化病變部位與人也不相同[13]，因此，許多在鼠和兔上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果很難直接應(yīng)用于人體進(jìn)行進(jìn)一步的研究。豬的膽固醇代謝與人類極為相似，是高脂飼料引發(fā)的高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的理想動(dòng)物模型[5]。因此，本研究以五指山小型豬為動(dòng)物模型，分析了去勢(shì)和睪酮處理對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的血脂代謝紊亂的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，睪酮缺乏顯著增加高脂飲食誘導(dǎo)的小型豬血清膽固醇(TC和LDL-C)和甘油三酯水平，而給予外源性睪酮處理后，去勢(shì)小型豬血清膽固醇和甘油三酯水平則顯著降低。我們前期研究已證實(shí)，睪酮缺乏可顯著增加飼喂普通飼料豬的血清膽固醇和甘油三酯水平[14]，說(shuō)明睪酮缺乏對(duì)飼喂正常和高脂飼料豬的血脂代謝均有顯著影響。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，睪酮缺乏不僅影響高脂飲食小型豬血脂水平，還能促進(jìn)脂質(zhì)在小型豬肝臟內(nèi)沉積。Volzke等[15]研究表明，雄激素水平低下增加男性患非酒精性脂肪肝風(fēng)險(xiǎn)，這和我們發(fā)現(xiàn)的睪酮缺乏增加小型豬肝臟脂質(zhì)沉積的研究結(jié)果相一致。最新研究發(fā)現(xiàn)，高脂飲食誘導(dǎo)的高膽固醇血癥亦是引發(fā)非酒精性脂肪肝的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[16]。我們前面已證實(shí)，睪酮缺乏能增加高脂飲食小型豬血清TC和LDL-C水平，促進(jìn)高膽固醇血癥形成。所以，睪酮缺乏本身或睪酮缺乏引起的高膽固醇血癥均可能促進(jìn)小型豬肝臟脂質(zhì)沉積。

綜上所述，去勢(shì)能夠減少高脂飲食誘導(dǎo)的小型豬血清睪酮水平，增加血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯水平。給予外源性睪酮處理后，則能夠改善高脂飲食誘導(dǎo)的血脂代謝紊亂，減少肝臟脂質(zhì)沉積。

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〔修回日期〕2014-11-21