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武漢地區(qū)馬鈴薯Y病毒株系的類型

陳汝豪1, 2, 3, 4，王靖惠1, 2, 3, 4，姚妮娜1, 2, 3, 4，柳俊1, 2, 3, 4，NIE Xianzhou5，聶碧華1, 2, 3, 4*

（1.園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.國家蔬菜改良中心華中分中心；3.湖北省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北武漢430070；5.加拿大農(nóng)業(yè)與農(nóng)業(yè)食品部馬鈴薯研究中心,加拿大新不倫瑞克，弗雷德里克頓E3B4Z7 )

馬鈴薯是僅次于水稻、小麥和玉米的世界第四大糧食作物，在全世界耕地面積減少和谷物類增產(chǎn)幅度下降的形勢(shì)下，作為最大的塊莖作物，馬鈴薯成為未來發(fā)展中國家糧食安全的重要保障[1,2]。馬鈴薯是無性繁殖作物，病毒病尤其嚴(yán)重，也是導(dǎo)致馬鈴薯種薯退化的主要原因[3]。據(jù)報(bào)道，有近40種病毒和2種類病毒能侵染馬鈴薯，其中9種病毒和1種類病毒被認(rèn)為分布廣泛且危害嚴(yán)重，其中馬鈴薯Y病毒（PVY）造成的產(chǎn)量損失可達(dá)80%[4,5]。

PVY有豐富的株系多樣性，包括普通株系（PVYO），煙草葉脈壞死株系（PVYN），重組株系（PVYN : O和PVYNTN）等[6,7]。近些年，PVYNTN在世界許多國家和地區(qū)相繼出現(xiàn)，由于它能導(dǎo)致塊莖發(fā)生環(huán)狀壞死而受到廣泛關(guān)注[6,8]。而PVYO的一種致病性更強(qiáng)的變異型PVYO-FL也超過原有的PVYO成為加拿大東部地區(qū)主要PVYO類型[9]。表明PVY的株系組成不僅復(fù)雜，而且在發(fā)生變化。

常規(guī)的ELISA病毒檢測(cè)通常不能區(qū)分PVY的各個(gè)株系，因此國內(nèi)鮮有PVY株系分析的報(bào)道。本研究對(duì)武漢地區(qū)馬鈴薯田間收集的PVY樣品進(jìn)行了基因型分析，初步了解了PVY的株系類型的組成，對(duì)PVY的防治和新品種選育都有重要的意義。

1　材料與方法

1.1樣品收集和總RNA的提取

2012年春季，在武漢市華中農(nóng)業(yè)大學(xué)馬鈴薯田間依據(jù)PVY引起的植株花葉、失綠和壞死等常見癥狀，采集了124份葉片樣品，并用Na2SO3法提取總RNA[10]，具體步驟如下：用葉汁提取儀榨取6滴葉片汁液加入300 μL抽提緩沖液（含0.1M Tris-HCl, 2.5 mM MgCl2, 0.65%的Na2SO3，20 μL/mL 的DNase I），在37℃水浴中孵育10 min。加入200 μL水飽和酚充分搖勻，在4℃、12 000 r/min離心15 min（下同）。取上清液加入400 μl苯酚/氯仿/異戊醇（25?24?1），充分搖勻后離心。收集上清液加入50 μL 3 M醋酸鈉和500 μl異丙醇，震蕩搖勻，-70℃放置40 min，離心傾去上清液。用70%的乙醇洗滌沉淀，干燥后用無菌水溶解RNA沉淀，于-20℃存儲(chǔ)。

1.2PVY病毒的RT-PCR檢測(cè)

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（RT）用2.5 μL RNA（400 ng）在68℃孵育8 min，在冰上冷卻3 min使RNA變性。加入7.5 μL RT反應(yīng)混合液，使最終各組分濃度達(dá)到要求（20 ng/μL 6-9 bp隨機(jī)引物, 50 mM Tris-HCl, pH 8.3, 75 mM KCl, 10 mM DTT, 2.5 mM MgCl2, 1.5 mM4 種dNTPs,20 URNasin以及200 UMMLV-RT），然后在42℃孵育60 min，最后95℃3 min終止反應(yīng)。

PVY以及COX1基因（BA000042）檢測(cè)的PCR反應(yīng)用2 μL的樣品cDNA模板在25 μL體系中進(jìn)行（含1×PCR buffer，3 mM MgCl2, 0.625 U Taq，4 mM每種dNTPs，1 μM各引物）。PCR反應(yīng)：94.0℃變性1.5 min，接著94.0℃變性45 s；57℃退火45 s；72℃延伸1 min；36個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。8 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)并拍照。PVY及COX1基因檢測(cè)引物分別產(chǎn)生480 bp和500 bp的特征條帶[11]。所用引物見表1。

表1　馬鈴薯PVY病毒檢測(cè)和分型的PCR引物Table 1 Primers for PCR detection and differentiation for potato virus Y

1.3PVY株系類型分析

PVY陽性樣品的株系類型分析分為三步：1）P1基因分析[12]，用一個(gè)三重PCR區(qū)分PVYO與PVYN/N:O/NTN類型，其中856 bp為共有帶型，443 bp為PVYN/N:O/NTN類型的特征帶，281 bp為PVYO特征帶；2）重組位點(diǎn)檢測(cè)[6]，以區(qū)分PVYN、PVYN:O和PVYNTN三種株系，其中PVYN株系沒有重組位點(diǎn)，PVYN:O株系含有641 bp的重組位點(diǎn)1（RJ1），而PVYNTN株系含有所有三個(gè)重組位點(diǎn)（RJ1、RJ2和RJ3）；3）三重RT-PCR分析鑒定PVYO的強(qiáng)毒（PVYO-FL）和弱毒（PVYO-RB）變異型[9]，其中464 bp為強(qiáng)毒PVYO-FL類型的特征帶，399 bp為弱毒PVYO-RB類型的特征帶，238 bp為兩種PVYO類型的共有條帶。上述RT-PCR反應(yīng)引物見表1。

2　結(jié)果與分析

2.1PVY病毒的RT-PCR檢測(cè)

對(duì)樣品PVY以及內(nèi)參基因COX1的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。124個(gè)樣品中93個(gè)樣品中檢出PVY 480 bp的特征帶，占總數(shù)的75.0%（圖1A），內(nèi)參基因500 bp的特征條帶均十分明顯（圖1B）。由此可見，根據(jù)植株葉片癥狀來采集PVY病毒樣品的方法是高效、可行的。

2.2PVY病毒株系類型分析

對(duì)上述93個(gè)PVY陽性樣品進(jìn)行進(jìn)一步基因型的分析以調(diào)查PVY的株系組成。首先進(jìn)行P1基因分析。如圖2A所示，所有PVY陽性樣品均擴(kuò)增出856 bp的共有條帶，而其中56個(gè)樣品僅擴(kuò)增出443 bp特征帶，其P1基因?yàn)镻VYN/NTN/N:O類型，占60.2%；19個(gè)樣品只擴(kuò)增出281 bp的特征帶，其P1基因?yàn)镻VYO類型，占20.4%；還有18個(gè)樣品具有443 bp和281 bp兩條特征帶，推斷為上述兩種類型PVY的混合侵染，占19.4%。

圖1　RT-PCR檢測(cè)馬鈴薯田間樣品的PVY和內(nèi)參基因COX1Figure 1 RT-PCR assay for detection of PVY and COX1 gene in RNA samples of field collected potato leaves

繼續(xù)對(duì)74個(gè)PVYN/N:O/NTN類型PVY樣品進(jìn)行重組位點(diǎn)分析，部分樣品電泳結(jié)果如圖2B所示。3個(gè)樣品沒有擴(kuò)增出任何特征帶，推斷它們是沒有重組位點(diǎn)的PVYN，占總數(shù)的4.0%；有9個(gè)樣品擴(kuò)增出一條641 bp的特征條帶，推斷它們是具有一個(gè)重組位點(diǎn)的PVYN:O，占12.2%。其余62樣品擴(kuò)增出了RJ1（641 bp）和RJ2（448 bp）兩個(gè)重組位點(diǎn)，比陽性材料PVYNTN少了一個(gè)RJ3（290 bp）重組位點(diǎn)，推斷它們可能是PVYNTN，占83.8%。

對(duì)另外37個(gè)PVYO類型樣品進(jìn)行了CP基因分析以區(qū)分它們可能的致病力強(qiáng)弱，部分樣品電泳結(jié)果如圖2C所示。所有樣品都含有238 bp的PVYO共有的條帶，其中有26個(gè)樣品具有464 bp特征帶，屬于強(qiáng)毒的PVYO-FL變異型，占PVYO總數(shù)的70.3%。其余樣品與陽性對(duì)照PVYO-RB一樣，只有一條238 bp的共有條帶，雖然缺少299 bp的特征帶，推斷為弱毒的PVYO-RB變異型，占PVYO總數(shù)的29.7%。

圖2　PVY陽性樣品的基因型分析Figure 2 RT-PCR based genotyping assay of PVY positive samples

3　討論

本研究用RT-PCR的方法對(duì)依據(jù)癥狀采集的馬鈴薯葉片樣品進(jìn)行了PVY檢測(cè)。結(jié)果顯示，根據(jù)PVY在馬鈴薯上引起的花葉、失綠和壞死等常見癥狀來進(jìn)行取樣，獲得PVY陽性樣品的比率可達(dá)75.0%。而那些PVY檢測(cè)為陰性又表現(xiàn)出疑似癥狀的樣品，可能由其它病毒或其它原因?qū)е隆?/p>

通過對(duì)這些PVY陽性樣品的P1基因、重組位點(diǎn)以及CP基因的RT-PCR分析，進(jìn)一步明確了這些PVY樣品的株系類型。包含混合侵染，本研究在93份PVY陽性樣品中共檢測(cè)出111份陽性的各株系分離物，5種PVY株系或分離物PVYNTN、PVYO-FL、PVYO-RB、PVYN:O和PVYN出現(xiàn)的頻度和所占比例分別為62（55.9%）、26（23.4%）、11 （9.9%）、9（8.1%）和3（2.7%）。表明樣品中含有所有檢測(cè)的5種PVY株系或分離物，其中以PVYNTN和PVYO-FL為主要流行的PVY，它們占總數(shù)的79.3%。

PVYNTN在本次檢測(cè)中發(fā)生頻率如此高并非偶然，在北美、中國等地相繼報(bào)道PVYNTN正有流行的趨勢(shì)[13,14]，而且本次對(duì)其重組位點(diǎn)的分析顯示，所有檢查的PVYNTN都只發(fā)現(xiàn)兩個(gè)重組位點(diǎn)而不是典型的三個(gè)重組位點(diǎn)，從中國湖南分離的PVYNTN也只檢測(cè)出上述兩個(gè)重組位點(diǎn)，進(jìn)一步分析顯示該P(yáng)VYNTN的第三個(gè)重組位點(diǎn)的位置發(fā)生了變化，導(dǎo)致檢測(cè)失敗[8]。最近對(duì)PVYO株系進(jìn)一步依據(jù)致病力的強(qiáng)弱分為PVYO-FL、PVYO-RB兩個(gè)亞型，在加拿大等地的檢測(cè)分析顯示，致病力更強(qiáng)的PVYO-FL正慢慢占據(jù)主要地位[9,13]，本研究初步分析的結(jié)果也顯示，近七成PVYO為PVYO-FL類型。

PVY有復(fù)雜的株系類型，是侵染馬鈴薯的主要病毒之一。本研究提供的PVY株系組成信息對(duì)本地區(qū)的PVY防治和品種選育工作具有一定的指導(dǎo)意義。

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摘要：馬鈴薯Y病毒（PVY）是嚴(yán)重危害我國馬鈴薯生產(chǎn)的主要病毒之一。本研究通過RT-PCR的方法，對(duì)依據(jù)癥狀采集的124份馬鈴薯葉片樣品進(jìn)行了病毒檢測(cè)，并對(duì)其中PVY陽性樣品進(jìn)行了株系類型分析。結(jié)果顯示，在93份PVY陽性樣品中，PVYN/NTN/N?O類型株系占60.2%，而PVYO普通株系占20.4%，還有18個(gè)樣品（19.4%）顯示受到兩種類型PVY的混合侵染。進(jìn)一步分析表明，在PVYN/NTN/N?O類型株系中，PVYNTN、PVYN?O和PVYN三種株系分別占83.8%、12.2%和4.0%；而PVYO普通株系中，PVYO-FL和PVYO-RB兩種變異型各占70.3%和29.7%。本研究結(jié)果顯示，PVYNTN和PVYO-FL是檢測(cè)樣品中主要的PVY株系，該結(jié)果為指導(dǎo)馬鈴薯PVY的防治提供一定的依據(jù)。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；馬鈴薯Y病毒；多樣性；RT-PCR

Potato Virus Y (PVY) Strain Status in Potato Samples Collected from Wuhan Area

CHEN Ruhao1,2,3,4, WANG Jinghui1,2,3,4, YAO Nina1,2,3,4, LIU Jun1,2,3,4, NIE Xianzhou5，NIE Bihua1,2,3,4* ( 1. Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education; 2. National Center for Vegetable Improvement (Central China); 3. Potato Engineering and Technology Research Center of Hubei Province; 4. College of Horticulture and Forestry Sciences,

Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei 430070, China；5. Potato Research Center, Agriculture and Agri-Food Canada, 850 Lincoln Road, P. O. Box 20280, Fredericton NBE3B4Z7, Canada )

Abstract:Potato virusY(PVY) is one of the main viruses which restricts potato production in China.In this study, 124 leaf samples were collected in potato field according to the foliar symptoms. RNAswere extracted andRT-PCRmethods were used for the strain analysis of thosePVYpositive samples.The results showed that 60.2%PVYN/NTN/N:Oand20.4%PVYOweredetected in 93 PVYpositive samples, while 18 samples (19.4%) were infected by both. Furthermore, 83.8% PVYNTN, 12.2% PVYN:Oand 4.0%PVYNweredetectedamong PVYN/NTN/N :Ogroupsamples,respectively.Meanwhile,PVYOgroup samples were consisted of 70.3% PVYO-FL and 29.7% PVYO-RB, respectively. The investigation revealed that PVYNTNand PVYO-FL were the epidemic PVYstrains/isolates insamplescollected in this study,whichmight provide importantanduseful information for PVYcontrol.

Key Words:potato; potato virus Y; diversity; reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）

*通信作者（Corresponding author）：聶碧華，副教授，博士，主要從事馬鈴薯病毒互作研究，E-mail: nbihua@mail.hzau.edu.cn。

作者簡(jiǎn)介：陳汝豪（1990-），男，碩士研究生，從事馬鈴薯病毒互作研究。

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（CARS-10-P08）；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31101191）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目（2011QC080）。

收稿日期：2014-11-06

文章編號(hào)：1672－3635（2015）01-0037-05

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

中圖分類號(hào)：S532