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馬鈴薯接骨木鐮刀菌的分子檢測(cè)

高云飛1，閔凡祥1，王文重1，楊帥1，魏琪1，呂典秋1*，郭梅1，呂濤2

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江哈爾濱150086；2.黑龍江省經(jīng)濟(jì)作物技術(shù)指導(dǎo)站，黑龍江哈爾濱150090 )

摘要：接骨木鐮刀菌是馬鈴薯干腐病的主要致病菌，給黑龍江省馬鈴薯造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。采用馬鈴薯干腐病引物L(fēng)DJ1對(duì)馬鈴薯干腐病、馬鈴薯晚疫病、馬鈴薯早疫病、馬鈴薯黑痣病的致病菌的ITS序列進(jìn)行測(cè)定，只有馬鈴薯干腐病菌擴(kuò)增出560 bp特異性片段。再分別對(duì)接骨木鐮刀菌、燕麥鐮刀菌和茄病鐮孢變種的ITS序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，針對(duì)接骨木鐮刀菌設(shè)計(jì)了特異引物L(fēng)2，擴(kuò)增特異性產(chǎn)物為278 bp，該引物所建立的PCR檢測(cè)體系可檢測(cè)DNA含量在50 pg/μL以上的目的基因。

關(guān)鍵詞：馬鈴薯；ITS；PCR；接骨木鐮刀菌；分子檢測(cè)

馬鈴薯干腐病是由鐮刀菌（Fusarium spp．）引起的一種真菌病害，可以導(dǎo)致薯塊高度腐爛，是馬鈴薯貯藏的主要病害之一[1]。在窖藏過(guò)程中，由于窖溫濕度適宜，干腐病會(huì)大面積發(fā)生，往往會(huì)導(dǎo)致“爛窖”，一般年份損失率約15%~35%，重災(zāi)年高達(dá)50%左右，已經(jīng)給中國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前，馬鈴薯的干腐病已經(jīng)成為影響黑龍江省馬鈴薯儲(chǔ)藏和商品品質(zhì)的重大病害，導(dǎo)致其商品薯率大幅下降，嚴(yán)重影響其經(jīng)濟(jì)和食用價(jià)值。不同國(guó)家報(bào)道的病原菌的優(yōu)勢(shì)種有所不同，但報(bào)道接骨木鐮刀菌（F. sambucinum）為主要病原的文獻(xiàn)較多[3-5]。據(jù)研究，它也是黑龍江省馬鈴薯干腐病主要致病菌之一[6]。依據(jù)鐮刀菌的rDNA區(qū)域保守序列設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)馬鈴薯干腐病主要病原菌進(jìn)行了分子鑒定，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)體系的建立，從而確立一套馬鈴薯干腐病的快速、靈敏、準(zhǔn)確的分子檢測(cè)體系，這些研究成果對(duì)于黑龍江省馬鈴薯真菌病害檢測(cè)水平的提高具有重要的實(shí)踐指導(dǎo)意義。

1　材料與方法

1.1供試菌株

本試驗(yàn)所用菌株（表1）均由農(nóng)業(yè)部脫毒馬鈴薯種薯質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（哈爾濱）提供，馬鈴薯塊莖樣品2012年來(lái)自于重慶地區(qū)。

表1　供試菌株采集信息Table 1 Information of Fungi strains collected

1.2主要試劑和儀器

DNA提取主要藥品：液氮、酚、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、β-琉基乙醇、EDTA。

PCR及電泳所用藥品：TaKaRa公司的Premix Taq，瓊脂糖Agarose購(gòu)自Spain，TaKaRa公司的10x Loading Bufer、DNA Marker-DL2000。

主要儀器：PCR儀（TaKaRa公司），德國(guó)Sigma高速冷凍離心機(jī)，金屬水浴鍋，北京六一儀器廠DYY-8C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、水平電泳槽，凝膠成像系統(tǒng)Alpha Innotech。

1.3主要方法

改良的SDS具體方法：

將單孢培養(yǎng)物接種于PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d以上，用接種針挑去菌絲。取50 mg菌絲在液氮中研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中。加750 μL DNA抽提液(1 mol/L Tris-HCl pH 8.0，0.5 mol/L EDTA，pH 8.0，l0% SDS，0.7313 g NaCl)，20 μL β-巰基乙醇，充分混勻，68℃恒溫金屬浴60 min。加入750 μL酚?氯仿?異戊醇（25?24?1），震蕩混勻，4℃，13 000 r/min離心15 min。取上清，再加入等體積的氯仿?異戊醇（24?1），輕輕顛倒均勻，13 000 r/min，4℃離心15 min。取上清，加入-20℃中存放的異丙醇，其體積是上清液的2.5倍，放置沉淀2 h以上。然后在13 000 r/min離心15 min，后棄上清，留取沉淀物，再用70%的酒精洗滌沉淀3次，將沉淀物晾干，晾干后加入100 μL無(wú)菌水溶解沉淀。

常規(guī)PCR鑒定：

在ITS區(qū)采用特異檢測(cè)馬鈴薯鐮刀菌干腐病引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度560 bp[7]。

Forward Primer LDJ1: 5’-GTAAAAGTCGTAACAAGGTC-3’

Reverse Primer LDJ1: 5’-AAGTTCAGCGGGTATTC-3’

利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)接骨木鐮刀菌特異性擴(kuò)增引物，擬擴(kuò)增片段長(zhǎng)度278 bp。

Forward Primer L2: 5’-CGCCAGAGGACCCAAACT-3’

Reverse Primer L2: 5’-GCCGCCAGAAGGGCAGAGC-3’

以上兩對(duì)引物均由上海生工合成。

反應(yīng)體系：

Premix 12.5 μL

Forward Primer LDJ1 1.0 μL

Reverse Primer LDJ1 1.0 μL

DNA模板1.0 μL

ddH2O補(bǔ)足至25 μL

引物L(fēng)DJ1反應(yīng)條件：

預(yù)變性94℃90 s（變性94℃35 s，退火56℃30 s，延伸72℃60 s）變性至延伸共35個(gè)循環(huán)，最后一次延伸72℃5 min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4℃冰箱保存?zhèn)溆没蛩蜏y(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。

引物L(fēng)2反應(yīng)條件：

預(yù)變性94℃90 s（變性94℃35 s，退火59℃30 s，延伸72℃60 s）變性至延伸共35個(gè)循環(huán)，最后一次延伸72℃5min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4℃冰箱保存。

電泳檢測(cè)：

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%濃度的瓊脂糖凝膠在1×TAE下電泳，利用凝膠成像儀在紫外光下檢測(cè)并拍照。

2　結(jié)果與分析

2.1引物L(fēng)DJ1特異性鑒定

由圖1可知，在馬鈴薯干腐病的DNA特異性檢測(cè)中，鐮刀菌引物擴(kuò)增出特異性條帶560 bp，而沒有其他馬鈴薯病害非特異性條帶出現(xiàn)。

2.2引物L(fēng)2特異性檢測(cè)

由圖2可知，在接骨木鐮刀菌的DNA特異性檢測(cè)中，唯有接骨木鐮刀菌擴(kuò)增出特異性條帶278 bp，而其他鐮刀菌沒有擴(kuò)增出特異性條帶。

圖1　特異性鑒定Figure 1 Specific identification

圖2　接骨木鐮刀菌特異性鑒定Figure 2 Specific identification of F.sambucinum

圖3　引物L(fēng)2的靈敏度鑒定Figure 3 Sensitivity of the primer L2

2.3引物L(fēng)2靈敏度檢測(cè)

由圖3可以看出，引物對(duì)鐮刀菌DNA的檢測(cè)靈敏度隨著DNA濃度的降低而降低，在50 pg/μl時(shí)達(dá)到最低，此后無(wú)目的條帶出現(xiàn)，因此，針對(duì)該引物所建立的PCR檢測(cè)體系可檢測(cè)含量在50 pg/μl以上的目的基因。

2.4鐮刀菌的PCR檢測(cè)應(yīng)用

采用改良的SDS法從馬鈴薯塊莖中提取總DNA，在經(jīng)過(guò)晾干后溶解在無(wú)菌水中，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA的檢驗(yàn)。從圖4中看出DNA除了12、13、18號(hào)樣品未滿足PCR分離基因的要求，其余樣品均能夠滿足要求，可以用于進(jìn)一步的試驗(yàn)。

采用鐮刀菌rDNA-ITS特異引物L(fēng)DJ1對(duì)馬鈴薯塊莖進(jìn)行PCR檢測(cè)，其中5個(gè)樣品為無(wú)發(fā)病癥狀薯塊的DNA，擴(kuò)增結(jié)果如圖5所示。另外有10個(gè)樣品為有發(fā)病癥狀薯塊的DNA，擴(kuò)增結(jié)果如圖6所示。

圖4　馬鈴薯塊莖DNA的提取Figure 4 Extraction of DNA from potato tuber

圖5　引物L(fēng)DJ1對(duì)無(wú)病癥的薯塊的檢測(cè)應(yīng)用Figure 5 Detection application of healthy tuber by primer LDJ1

圖6　引物L(fēng)DJ1對(duì)有病癥的薯塊的檢測(cè)應(yīng)用Figure 6 Detection application of diseased tuber by primer LDJ1

從圖5和圖6可以看出，對(duì)于沒有發(fā)病薯塊也可以擴(kuò)增出560 bp的特異性片段，這表明在這些薯塊中已經(jīng)有鐮刀菌的侵染，特異引物在馬鈴薯塊莖進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，對(duì)于具有干腐病癥狀的塊莖都可以擴(kuò)增出大小為560 bp的特異性條帶，由此結(jié)果可以看出，以此特異性引物為基礎(chǔ)的PCR檢測(cè)方法，可以直接用于檢測(cè)發(fā)病組織中的鐮刀菌。

2.5接骨木鐮刀菌的PCR檢測(cè)應(yīng)用

從圖7可看出，特異引物L(fēng)2在對(duì)馬鈴薯塊莖進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，對(duì)15個(gè)薯塊的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明有8號(hào)和16號(hào)2個(gè)薯塊的DNA中可以擴(kuò)增出大小為278 bp的特異性條帶，這表明接骨木鐮刀菌為此次檢測(cè)的部分薯塊的致病菌，由以上結(jié)果看出，此特異性引物為基礎(chǔ)的PCR檢測(cè)方法，可以直接用于檢測(cè)發(fā)病組織中的接骨木鐮刀菌。

圖7　引物L(fēng)2對(duì)薯塊的檢測(cè)應(yīng)用Figure 7 Detection application of tuber by primer L2

3　討論

現(xiàn)在對(duì)鐮刀菌的鑒定還是以形態(tài)學(xué)為主要手段，但是由于其有一定的局限性，受培養(yǎng)環(huán)境等因素影響。形態(tài)學(xué)鑒別既費(fèi)時(shí)費(fèi)力又程序繁瑣，而且菌株?duì)顟B(tài)易于發(fā)生變化，培養(yǎng)物狀態(tài)也具有多樣性，說(shuō)明鐮刀菌鑒定檢測(cè)的工作復(fù)雜性，而且不宜從發(fā)病初期的植株或塊莖中分離鑒定出鐮刀菌，耗時(shí)長(zhǎng)，難以做到對(duì)病害的早期檢測(cè)。因此，建立快速、準(zhǔn)確的馬鈴薯真菌病害檢測(cè)技術(shù)具有重要的實(shí)際意義。

隨著近幾年的發(fā)展，分子生物學(xué)鑒定分類也迅速發(fā)展，對(duì)ITS序列的研究不僅能解決許多形態(tài)學(xué)分類研究中的疑難問(wèn)題，而且在對(duì)植物病原菌的檢測(cè)和鑒定上起到了事半功倍的效果。利用ITS序列設(shè)計(jì)特異性引物來(lái)鑒定鐮刀菌種以在小麥、棉花、玉米等作物上有成功例子，但國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道[8-10]。本研究采用了改良的SDS方法，提取效果與張寶俊等[11]、韓峰等[12]報(bào)道相一致，進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)也驗(yàn)證LDJ1所建立的PCR檢測(cè)體系可檢測(cè)含量在1 pg/μL以上的目的基因的可行性。特異性引物L(fēng)2可對(duì)接骨木鐮刀菌進(jìn)行檢測(cè)，在L2所建立PCR檢測(cè)體系可檢測(cè)含量在50 pg/μL以上的目的基因，可初步用于窖藏馬鈴薯接骨木鐮刀菌干腐病的檢測(cè)。同時(shí)滿足后續(xù)研究的進(jìn)行，進(jìn)一步完善馬鈴薯鐮刀菌檢測(cè)鑒定技術(shù)的研究工作，為馬鈴薯干腐病早期檢測(cè)奠定理論基礎(chǔ)。本研究使用了接骨木鐮刀菌、燕麥鐮刀菌和茄病鐮孢變種等這三種菌，數(shù)量有限，有待于后續(xù)研究完善。

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Molecular Detection for Fusarium sambucinum on Potato

GAO Yunfei1, MIN Fanxiang1, WANG Wenzhong1, YANG Shuai1, WEI Qi1, LU Dianqiu1*, GUO Mei1, LU Tao2

( 1. Virus-free Seedling Research Institute, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin, Heilongjiang 150086, China; 2. Heilongjiang Economic Crop Technical Guidance Station，Harbin, Heilongjiang 150090, China)

Abstract:F. sambucinum is the main pathogenic bacterium bringing about potato dry rot and causes economic losses to some extent in Heilongjiang Province. Tests were made to the ITS sequence of Fusarium spp., Phytophthora infestans,Alternaria solani and Rhizoctonia solani using the primer LDJ1, and 560 bp specific fragment was amplified only from Fusarium spp.. Comparative analysis of BLAST was conducted on ITS sequence of F. sambucinum, F. avenaceum, and F. solani var.coeruleum, and the specific primer L2 was designed. The target band amplified was 278 bp. The sensitivity of PCR detection system based on this primer was 50 pg/μLfor the target gene.

Key Words:potato；ITS；PCR；F. sambucinum；molecular detection

*通信作者（Corresponding author）：呂典秋，博士，研究員，主要從事馬鈴薯栽培生理和生物技術(shù)研究，E-mail: small_potatoes@126.com。

作者簡(jiǎn)介：高云飛（1984-），男，助理研究員，主要從事馬鈴薯真菌病害研究。

基金項(xiàng)目：科技部國(guó)際科技合作計(jì)劃項(xiàng)目（2010DFA32810）；科技部“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃研究課題（2012BAD06B02）；哈爾濱市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2010AA6CN071）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)資金資助（CARS-10-P14）；黑龍江省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程。

收稿日期：2014-03-01

文章編號(hào)：1672－3635（2015）01-0028-05

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

中圖分類號(hào)：S532