王 瓊 王瑋文 李 曼 杜 偉 邵 楓

(1北京大學(xué)心理學(xué)系和行為與心理健康北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100871)(2中國科學(xué)院心理健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國科學(xué)院心理研究所,北京 100101)

1 引言

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)是哺乳動物腦內(nèi)分布最廣、含量最高的一類神經(jīng)營養(yǎng)因子,廣泛分布于海馬(hippocampus)和內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(medial frontal cortex,mPFC)等腦區(qū)(Baquet,Gorski,&Jones,2004),能維持成熟神經(jīng)元正常功能,具有營養(yǎng)、支持和保護(hù)作用,并且能夠促進(jìn)神經(jīng)元的修復(fù)和再生(Greenberg,Xu,Lu,&Hempstead,2009;Lynch,Rex,Chen,&Gall,2008)。BDNF的受體分為兩類,p75受體和TrkB受體。BDNF主要通過與 TrkB受體特異性結(jié)合,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)其一系列神經(jīng)營養(yǎng)和支持功能(Huang &Reichardt,2003;Kaplan &Miller,2000)。此外,BDNF作為神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)中的重要成員,在學(xué)習(xí)和記憶的過程中也起著重要的調(diào)節(jié)作用(Bekinschtein,Cammarota,Izquierdo,&Medina,2008;Peters,Dieppa-Perea,Melendez,&Quirk,2010)。

Morris水迷宮學(xué)習(xí)是常用的檢測動物空間學(xué)習(xí)記憶能力的行為范式。而水迷宮的逆反學(xué)習(xí)(reversal learning)能力則觀察的是當(dāng)環(huán)境發(fā)生改變時(shí)個體迅速調(diào)整已建立行為模式的能力,是個體認(rèn)知靈活性的重要體現(xiàn)(Miller,2000)。以往的研究表明,空間學(xué)習(xí)和逆反學(xué)習(xí)能力受海馬,mPFC和伏隔核(nucleus accumbens,NAc)等多個腦區(qū)的調(diào)節(jié)(Casta?é,Theobald,&Robbins,2010;Ferry,Lu,&Price,2000;Mizoguchi,Shoji,Tanaka,&Tabira,2011;Watson &Stanton,2009)。

海馬(Hippocampus)作為記憶的關(guān)鍵腦區(qū),對個體的學(xué)習(xí)和記憶有著重要的調(diào)節(jié)作用(Watson &Stanton,2009),此外海馬的BDNF系統(tǒng)也對個體的認(rèn)知功能有著重要的影響。Chen等的研究結(jié)果顯示,學(xué)習(xí)過程與海馬突觸中BDNF受體的激活密切相關(guān)(Chen,Rex,Pham,Lynch,&Gall,2010)。不僅如此,特異性敲除海馬中BDNF基因可損傷小鼠的新異物體再認(rèn)和水迷宮空間學(xué)習(xí)能力(Heldt,Stanek,Chhatwal,&Ressler,2007)。此外,海馬BDNF水平的增高可提高動物認(rèn)知功能。例如,與其野生型小鼠相比,海馬中BDNF水平增高的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出水迷宮的逃離潛伏期及運(yùn)動距離顯著降低(Nakajo et al.,2008)。海馬單次給予 BDNF也可顯著縮短Morris水迷宮逆反學(xué)習(xí)中大鼠到達(dá)站臺的潛伏期及運(yùn)動距離(Cirulli,Berry,Chiarotti,&Alleva,2004)。此外,大鼠海馬中 BDNF mRNA水平的增高與Morris水迷宮中增強(qiáng)的空間記憶行為呈現(xiàn)顯著正相關(guān)(Falkenberg et al.,1992)。

mPFC廣泛參與了個體諸如計(jì)劃、問題解決、組織等高級認(rèn)知功能,并且與工作記憶功能緊密相關(guān)(Xing,Guo,Meng,Wei,&Li,2012)。許多研究都證實(shí)了mPFC的BDNF系統(tǒng)在調(diào)節(jié)個體認(rèn)知功能中起著重要的作用,但是這些研究的結(jié)果卻是不一致的。例如,有研究證實(shí)mPFC微注射BDNF可以顯著增強(qiáng)大鼠已習(xí)得條件性恐懼記憶的消退,加速新記憶的形成(Peters et al.,2010)。另一項(xiàng)研究則發(fā)現(xiàn)mPFC內(nèi)過量表達(dá)BDNF的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出顯著增加的焦慮樣行為,以及工作記憶損傷(Papaleo et al.,2011)。Choi等發(fā)現(xiàn)利用病毒特異性刪除小鼠邊緣前皮質(zhì)(prelimbic cortex,PL) BDNF基因可以顯著損傷動物恐懼記憶的習(xí)得,但并不影響其空間學(xué)習(xí)能力(Choi et al.,2010)。隨后,Choi等又利用TrkB受體點(diǎn)突變導(dǎo)致TrkB受體阻斷的TrkB小鼠開展了進(jìn)一步的深入研究,發(fā)現(xiàn) TrkB小鼠和病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的PL特異性BDNF刪除均可導(dǎo)致小鼠可卡因依賴的恐懼記憶學(xué)習(xí)損傷(Choi,Grourley &Ressler,2012)。以上的研究結(jié)果均表明 mPFC-BDNF對于記憶的學(xué)習(xí)和鞏固十分重要,然而迄今為止,并未發(fā)現(xiàn)有關(guān)阻斷mPFC-TrkB受體導(dǎo)致個體認(rèn)知功能發(fā)生改變的研究報(bào)道。

綜合以上內(nèi)容發(fā)現(xiàn),以往的研究主要關(guān)注的是單獨(dú)的海馬或mPFC腦區(qū)內(nèi)的BDNF變化對動物認(rèn)知能力的影響。然而許多研究都證實(shí)海馬和mPFC之間有著廣泛的神經(jīng)聯(lián)結(jié)(Swanson,1981;Jay,Glowinski,&Thierry,1989;Jay &Witter,1991),而且最近的一項(xiàng)研究表明,動物的逆反學(xué)習(xí)能力可能更多地依賴于mPFC-海馬之間的相互作用。例如,Sakata等發(fā)現(xiàn)選擇性的破壞BDNF表達(dá)的基因突變型BDNF-KIV小鼠在表現(xiàn)出Morris水迷宮逆反學(xué)習(xí)能力顯著降低的同時(shí)出現(xiàn)海馬 CA1遲發(fā)性長時(shí)程增強(qiáng)(late-phase long-term potentiation,L-LTP)和PFC的GABA能神經(jīng)元的損傷(Sakata et al.,2013)。

本實(shí)驗(yàn)室前期的研究工作發(fā)現(xiàn),慢性母嬰隔離(4 h/d,出生后1～21 d)在一定程度地降低成年早期(出生后56 d)大鼠在Morris水迷宮測試中的空間學(xué)習(xí)能力的同時(shí),顯著提高了其逆反學(xué)習(xí)能力(Wang,Li,Du,Shao,&Wang,2015)。此外,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)此逆反學(xué)習(xí)能力的增強(qiáng)與mPFC的BDNF表達(dá)之間呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(unpublished data)。那么mPFC- BDNF在空間學(xué)習(xí)和認(rèn)知靈活性方面發(fā)揮怎樣的作用？阻斷mPFC-TrkB受體是否能有效地調(diào)節(jié)成年大鼠在Morris水迷宮測試中的認(rèn)知能力？mPFC-海馬之間的相互作用是否也參與此調(diào)節(jié)過程？

本研究通過特異性阻斷mPFC的TrkB受體,觀察大鼠在曠場測試和Morris水迷宮測試空間學(xué)習(xí)和逆反學(xué)習(xí)中的各項(xiàng)行為改變,并進(jìn)一步通過免疫蛋白印跡(Western Blotting)技術(shù),考察特異性阻斷mPFC的TrkB受體對海馬BDNF表達(dá)的影響,探索mPFC-BDNF系統(tǒng)在調(diào)節(jié)個體認(rèn)知功能中的作用,為深入研究海馬和mPFC依賴的認(rèn)知功能及其神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制提供更為堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

2 實(shí)驗(yàn)材料和方法

2.1 動物

實(shí)驗(yàn)中所使用的雄性 Wistar大鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。所有動物在SPF級動物房內(nèi)飼養(yǎng),控制環(huán)境溫度 22 ± 2 ℃,相對濕度40～60%,晝夜明周期為 12 h / 12 h (光照時(shí)間 07：00～19：00)。實(shí)驗(yàn)期間大鼠飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn) Macrolon籠中,自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)程序獲得北京大學(xué)倫理審查委員會批準(zhǔn),符合國家動物管理和使用規(guī)則。

2.2 手術(shù)和注射

購入出生后35 d (PND 35)左右的大鼠,7 d適應(yīng)期結(jié)束后,將動物隨機(jī)分為兩組：TrkB受體阻斷組(ANA-12)和對照組(DMSO),并對兩組大鼠進(jìn)行腦立體定位手術(shù),本研究采用的立體定位手術(shù)實(shí)驗(yàn)方法在之前研究中有過介紹(Snyder,Wang,Han,McFadden,&Valentino,2012)。通過氣體麻醉機(jī)使用異氟烷(2%)麻醉大鼠,并將大鼠固定于立體定位儀(STOELTING,USA),剃去手術(shù)部位毛發(fā),使用碘伏和 75%酒精消毒,隨后切開頭皮,分離皮下組織,充分暴露頭骨前囟。調(diào)整耳插位置,使前囟和后囟處于同一水平面。參照大鼠腦圖譜(Paxinos &Watson;2004),將不銹鋼導(dǎo)管(外徑0.67 mm,長6 mm;RWD Life Science Co.,Ltd,China)植入mPFC,mPFC的坐標(biāo)參考了以前的研究,為前囟前AP：3.2 mm;中縫內(nèi)外側(cè)ML：1.6 mm;顱骨平面下DV：3.2 mm (AP：+3.2 mm;ML：±1.6 mm;DV：-3.2 mm),傾斜角度15° (Gilmartin,Kwapis,&Helmstetter 2012)。用丙烯酸樹脂將螺絲和套管固定在顱骨上,在套管內(nèi)插入內(nèi)芯(外徑0.3 mm,長度6 mm;RWD Life Science Co.,Ltd,China)防止套管堵塞。手術(shù)后恢復(fù)7 d,然后進(jìn)行腦區(qū)給藥。

腦區(qū)給藥實(shí)行雙側(cè)注射,將微量注射器(HAMILTON,USA)與注射內(nèi)管(外徑0.3 mm,長8 mm;RWD Life Science Co.,Ltd,China)以及 PE 管(外徑1.1 mm,內(nèi)徑,0.6 mm;RWD Life Science Co.,Ltd,China)連接,將注射內(nèi)管插入套管內(nèi),通過全自動微注射泵(Harvard Apparatus,USA)向大鼠的雙側(cè)目標(biāo)腦區(qū)分別注射適量藥物及溶質(zhì)。TrkB受體阻斷劑ANA-12 (SML0209,Sigma)的用藥時(shí)間和劑量參照了以往的研究(Greenberg et al.,2013;Spaeth,Kanoski,Hayes,&Grill,2012)。將ANA-12溶于二甲基亞砜DMSO (D2650,Sigma)中,配制濃度為 15μg/μl的溶液,并用人工腦脊液(NaCl 130 mM,KCl 13 mM,NaHPO1.25 mM,NaHCO26 mM,MgCl1 mM,葡萄糖10 mM,CaCl2 mM)按1：1稀釋上述溶液,得到7.5μg/μl的 ANA-12 溶液。向 ANA-12 組大鼠的每側(cè)mPFC 注射 7.5μg/μl的 ANA-12 溶液 0.2 μl,雙側(cè)注射,每只大鼠共注射 0.4 μl溶液,含 3μg ANA-12,每天一次,連續(xù)7天。向DMSO組大鼠的每側(cè) mPFC注射0.2 μl 50%的DMSO溶液,雙側(cè)注射,每只大鼠共注射0.4 μl 50%的DMSO溶液,每天一次,連續(xù)7天。注射完畢注射器需停留1min,以保證藥物充分滲透避免拔管倒流,注射完畢以內(nèi)芯封閉插管。藥物注射結(jié)束后,進(jìn)行各項(xiàng)行為測試。全部實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后,斷頭處死大鼠,剝離大腦,觀察注射位點(diǎn),對照大鼠腦圖譜(Paxinos &Watson,2004)剔除定位不準(zhǔn)確的大鼠。

2.3 行為測試

2.3.1 曠場測試

本研究采用的曠場測試模型沿襲了本實(shí)驗(yàn)室之前研究中的范式(Wang,Li,et al.,2015),其裝置由一個直徑150cm、高50cm的圓形水缸構(gòu)成,中心區(qū)域被定義為以裝置中心為圓點(diǎn),直徑 60cm 的圓形區(qū)域。行為測試在弱光環(huán)境(40 W)中進(jìn)行,以減少動物的焦慮感。測試開始時(shí)將動物隨機(jī)放置在曠場的中心區(qū)域,動物在曠場中的運(yùn)動總路程(distance traveled)以及在中心區(qū)域停留的時(shí)間(time spent in the central arena)使用行為監(jiān)測軟件(Etho Vision;Noldus)自動記錄。每只動物測試結(jié)束后都對測試裝置進(jìn)行清理。

2.3.2 Morris水迷宮測試

本研究使用的 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)范式在本實(shí)驗(yàn)室之前的研究中有過介紹(Han,Wang,Xue,Shao,&Li,2011;Wang,Li,et al.,2015),其裝置為一個直徑150cm的不銹鋼水池,注入深22cm的水(23 ± 2℃)。裝置被平均分為 4個象限,每次測試開始時(shí)動物被隨機(jī)放入其中一個象限。一個直徑8cm的圓形平臺被放置在裝置的某一個象限中,平臺表面距水面高度為 2cm。裝置周圍的視覺線索固定不變,測試在黑暗環(huán)境下進(jìn)行,以防止動物利用視覺觀察到水面下平臺的位置。將一臺紅外攝像機(jī)放置于裝置的正上方,捕捉動物的各項(xiàng)行為指標(biāo),并通過軟件進(jìn)行記錄和分析(Etho Vision;Noldus)。

(1)空間學(xué)習(xí)(Spatial learning)

空間學(xué)習(xí)任務(wù)包括連續(xù)4 d的實(shí)驗(yàn),將平臺固定放置在目標(biāo)象限中心距離水池壁約45cm處。在4 d的實(shí)驗(yàn)中,每只大鼠經(jīng)歷4次測試(trail),每次測試開始時(shí)將大鼠隨機(jī)放入水迷宮的平臺以外的 3個不同象限中,持續(xù)1min。隨后將大鼠引導(dǎo)至平臺處,讓其在平臺上停留10 s。每次測試結(jié)束后,將大鼠從水迷宮中拿出,用毛巾擦干后放回飼養(yǎng)盒內(nèi),約50 s后開始下次測試,使兩次測試間隔大約為60 s。測試過程中大鼠從放入迷宮至登上平臺的逃離潛伏期和在水迷宮中運(yùn)動總路程通過攝像頭記錄,并使用軟件(Etho Vision;Noldus)進(jìn)行分析。4 d的空間學(xué)習(xí)之后,接著進(jìn)行1 d的Probe test,測試時(shí)將水下平臺移出,并將大鼠放入沒有水下平臺的裝置內(nèi),記錄其在 4個象限中的運(yùn)動時(shí)間,并計(jì)算出大鼠在空間學(xué)習(xí)測試時(shí)水下平臺所在目標(biāo)象限中的運(yùn)動時(shí)間占總時(shí)間的百分比。Probe test每只大鼠僅進(jìn)行 1次測試(trail),持續(xù)1min。

(2)逆反學(xué)習(xí)(Reversal learning)

4 d的空間學(xué)習(xí)和Probe test之后,動物接受逆反學(xué)習(xí)測試。逆反學(xué)習(xí)測試時(shí)平臺被移至空間學(xué)習(xí)時(shí)正對著的相反象限,位于距離池壁約45cm的象限中心處。與大鼠在空間學(xué)習(xí)測試中一樣,每只大鼠每天接4個測試(trail),持續(xù)4 d。其余操作均與空間學(xué)習(xí)類似。

2.4 組織學(xué)檢查

行為測試結(jié)束后,用斬鼠器(北京合力科創(chuàng)科技發(fā)展有限公司,北京)將大鼠直接斷頭取腦,迅速剝離大腦將其用液氮快速冷凍后凍存于-80°C。Western Blotting測試前利用冰凍切片機(jī)(Leica,Germany),參照大鼠腦圖譜,剔除定位不準(zhǔn)確的大鼠。

2.5 免疫蛋白印跡(Western Blotting)

本研究所采用的 Western Blotting檢測方法是在之前研究的基礎(chǔ)上加以改進(jìn)而來的(Qi,Lin,Li,Pan,&Wang,2006)。冰凍切片機(jī)(Leica,Germany) -20°C微刺取出目標(biāo)腦區(qū)海馬組織,依據(jù)腦組織體積大小加入4°C預(yù)冷的組織裂解液(PH 7.5,含有5μg/ml亮抑酶肽,5μg/ml抑肽酶,5μg/ml胃蛋白酶抑制劑,5μg/ml胰蛋白酶抑制劑,2 mM EDTA,2 mM EGTA,1 mM DTT 和 0.5% NP-40) 50～70 μl,使用超聲破碎儀(SONICS &MATERIALS,USA)進(jìn)行超聲破碎。裂解物用BCA試劑盒(Thermo Scientific,USA)進(jìn)行蛋白濃度測定。將裂解物按一定比例加入5×烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)上樣緩沖液混合成一定濃度的樣本溶液后,95°C煮沸8min使蛋白變性。用 12%的 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離樣品蛋白(32μg);230 mA電流下轉(zhuǎn)膜1 h將凝膠電泳中蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC膜);NC膜用5%脫脂奶粉封閉液(脫脂奶粉和 TBST按比例配制)4°C孵育過夜。用 TBST洗膜 3次每次 10min;加入BDNF 一抗(ab46176,Abcam;1：1000)室溫振搖孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10min;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(Golden bridge,China;1：4000)后,室溫振搖孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10min;加入 ECL發(fā)光液(Millipore,USA),膠片曝光顯影。

用膜再生液洗膜40min后,TBST洗膜3次。膜用5%脫脂奶粉封閉液4°C孵育過夜。TBST洗膜 3次,每次10min;加入Beta actin一抗(Golden bridge,China ;1：1000)室溫振搖孵育2 h,TBST洗膜3次,每次 10min;加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗(Golden bridge,China;1：4000)后,室溫振搖孵育1 h,TBST洗膜3次,每次10min;加入ECL發(fā)光液,膠片曝光顯影。

蛋白含量定量分析指標(biāo)為其灰度值,采用 Lab Works4.6圖像獲取和分析軟件獲得(UVP,USA)。各目標(biāo)蛋白條帶以Beta actin作為內(nèi)參照,使用目標(biāo)蛋白和Beta actin灰度值的比值分析條帶間的差異。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(

M

±

SE

)表示,采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。曠場行為和 BDNF測試結(jié)果采用獨(dú)立樣本

t

檢驗(yàn)進(jìn)行分析,水迷宮測試結(jié)果采用重復(fù)測量的方差分析進(jìn)行分析處理,以測試天數(shù)為組內(nèi)變量,以藥物阻斷為組間變量。兩組之間的兩兩比較采用獨(dú)立樣本

t

檢驗(yàn)進(jìn)行分析。

p

＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 組織學(xué)檢查結(jié)果

通過對照大鼠腦圖譜確認(rèn)注射位點(diǎn)是否有效,最終將12只(6只/組)雙側(cè)位點(diǎn)均有效的大鼠納入行為數(shù)據(jù)分析和隨后的 Western Blotting檢測,注射位點(diǎn)如圖1所示。

圖1 mPFC立體定位手術(shù)組織學(xué)檢查結(jié)果

3.2 曠場測試結(jié)果

對曠場測試運(yùn)動距離數(shù)據(jù)結(jié)果分析顯示,ANA-12組大鼠和DMSO組大鼠在曠場總運(yùn)動距離的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

t

(11)=1.02,

p

=0.332。對曠場測試中心區(qū)域停留時(shí)間結(jié)果分析顯示,ANA-12組大鼠和DMSO組大鼠在曠場中心區(qū)域停留時(shí)間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

t

(11)=-0.09,

p

=0.932。

3.3 水迷宮測試空間學(xué)習(xí)結(jié)果

對空間學(xué)習(xí)的運(yùn)動距離數(shù)據(jù)結(jié)果分析顯示,測試天數(shù)的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

F

(1,8)=23.273,

p

＜0.001;藥物阻斷和測試天數(shù)交互作用的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

F

(3,8)=1.38,

p

=0.317;阻斷的主效應(yīng)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

F

(1,10)=3.71,

p

=0.083。對空間學(xué)習(xí)的逃離潛伏期數(shù)據(jù)結(jié)果分析顯示,測試天數(shù)的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

F

(1,8)=14.99,

p

=0.001;藥物阻斷和測試天數(shù)交互作用差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

F

(3,8)=1.71,

p

=0.243;阻斷的主效應(yīng)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

F

(1,10)=4.83,

p

=0.053。

Probe test的結(jié)果見圖2,數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,ANA-12組大鼠和DMSO組大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間顯著高于其它3個象限的停留時(shí)間。

圖2 水迷宮Probe test測試結(jié)果

3.4 水迷宮測試逆反學(xué)習(xí)結(jié)果

逆反學(xué)習(xí)的運(yùn)動距離結(jié)果見圖 3A,數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示測試天數(shù)的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

F

(1,8)=4.74,

p

=0.035;藥物阻斷的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

F

(1,10)=5.10,

p

=0.048;而藥物阻斷和測試天數(shù)交互作用差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

F

(3,8)=0.42,

p

=0.745。進(jìn)一步分析藥物阻斷的主效應(yīng)(

t

檢驗(yàn))發(fā)現(xiàn),阻斷 mPFC-TrkB受體顯著降低了大鼠的在逆反學(xué)習(xí)第4d測試的運(yùn)動距離,

t

(11)=-2.54,

p

=0.030。逆反學(xué)習(xí)的逃離潛伏期結(jié)果見圖 3B,數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示測試天數(shù)的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

F

(1,8)=5.12,

p

=0.029;藥物阻斷的主效應(yīng)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

F

(1,10)=6.90,

p

=0.025;而藥物阻斷和測試天數(shù)交互作用差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,

F

(3,8)=0.49,

p

=0.699。進(jìn)一步分析藥物阻斷的主效應(yīng)(

t

檢驗(yàn))發(fā)現(xiàn),阻斷 mPFC-TrkB受體顯著降低了大鼠的在逆反學(xué)習(xí)第3 d和第4 d測試的逃離潛伏期(Test Day 3：

t

(11)=-2.24,

p

=0.049;Test Day 4：

t

(11)=-3.06,

p

=0.012)。

圖3 阻斷mPFC-TrkB受體對水迷宮測試中逆反學(xué)習(xí)的影響

3.5 Western Blotting結(jié)果

對海馬BDNF蛋白表達(dá)的Western Blotting結(jié)果分析顯示(圖4),實(shí)驗(yàn)組(ANA-12：0.39±0.05)與對照組(DMSO：0.41±0.05)大鼠海馬內(nèi)BDNF的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,

t

(11)=-0.35,

p

=0.735。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),mPFC-TrkB受體的慢性阻斷顯著降低了大鼠在 Morris水迷宮逆反學(xué)習(xí)測試中的逃離潛伏期和運(yùn)動距離,即提高了大鼠的逆反學(xué)習(xí)能力,但是對大鼠在Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)測試和曠場測試中的各種行為并沒有產(chǎn)生顯著影響。同時(shí),慢性阻斷mPFC-TrkB受體也未導(dǎo)致大鼠海馬BDNF的表達(dá)產(chǎn)生顯著改變。

圖4 海馬BDNF及其內(nèi)參的蛋白條帶圖

首先,本研究發(fā)現(xiàn)慢性阻斷 mPFC-TrkB受體并未引起大鼠在曠場測試中各項(xiàng)行為的顯著改變。盡管以前的研究發(fā)現(xiàn),腹腔注射 TrkB受體拮抗劑ANA-12可以顯著降低小鼠在曠場(Open field)、高架十字迷宮(Elevated plus maze)和新環(huán)境進(jìn)食抑制(Novelty suppressed feeding)測試中的焦慮樣行為(Cazorla et al.,2011)。但用藥方式和動物種系的不同可能是導(dǎo)致結(jié)果不一致的原因。

其次,本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明,慢性阻斷mPFC-TrkB受體并未引起大鼠在 Morris水迷宮測試中的空間學(xué)習(xí)能力的顯著改變。迄今為止,并未發(fā)現(xiàn)有關(guān)阻斷 mPFC-TrkB受體對大鼠空間學(xué)習(xí)能力影響的報(bào)道。之前的研究多采用轉(zhuǎn)基因動物,來觀察mPFC內(nèi)BDNF變化與動物空間學(xué)習(xí)能力之間的關(guān)系。例如,有研究者發(fā)現(xiàn)特異性損壞BDNF啟動子IV基因的小鼠(BDNF-KIV)表現(xiàn)出PFC-BDNF表達(dá)顯著降低(Sakata et al.,2009),同時(shí)進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn) BDNF-KIV小鼠在水迷宮測試中的空間學(xué)習(xí)能力并未受到顯著影響(Sakata et al.,2013)。該報(bào)道與本研究結(jié)果一致。然而,另有一些相反的研究報(bào)道。如多巴胺D1受體基因敲除的小鼠在PFC-BDNF表達(dá)顯著降低的同時(shí),也表現(xiàn)出水迷宮空間學(xué)習(xí)能力的損傷(Xing et al.,2012)。這些研究結(jié)果的不一致性可能是由于具體實(shí)驗(yàn)操作的差異如基因干預(yù)和本實(shí)驗(yàn)采用的功能性阻斷以及動物品系的不同所導(dǎo)致的。

第三,研究結(jié)果提示,慢性阻斷mPFC-TrkB受體并未引起大鼠海馬BDNF表達(dá)的顯著改變。盡管本實(shí)驗(yàn)室以往的研究結(jié)果提示大鼠mPFC的BDNF表達(dá)與海馬的 BDNF水平之間可能呈現(xiàn)一定的反向關(guān)系,例如,慢性母嬰隔離(4 h/d,出生后1～21 d)可誘發(fā)成年早期(出生后56 d)大鼠mPFC的BDNF表達(dá)的顯著降低和海馬BDNF表達(dá)的顯著增高。但這種變化可能是母嬰隔離所導(dǎo)致的一系列復(fù)雜神經(jīng)生化改變中的一種體現(xiàn),這與單純阻斷 mPFC-TrkB受體引發(fā)的大腦內(nèi)部變化可能有差別的,這或許是本研究與之前研究不一致的潛在原因。此外,結(jié)合以往廣泛報(bào)道的海馬BDNF與 Morris水迷宮空間學(xué)習(xí)能力影響的研究(Cirulli et al.,2004;Falkenberg et al.,1992)。本研究發(fā)現(xiàn)的慢性阻斷 mPFC-TrkB受體并未影響 Morris水迷宮測試中的空間學(xué)習(xí)能力和海馬 BDNF表達(dá)的結(jié)果在行為和神經(jīng)生化兩個層面上是一致的。

最后,本研究發(fā)現(xiàn),慢性阻斷mPFC-TrkB受體可以顯著增強(qiáng)大鼠在 Morris水迷宮測試中的逆反學(xué)習(xí)能力。如前所述,本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的慢性母嬰隔離(4 h/d,出生后1～21 d)顯著提高了成年早期(出生后56 d)大鼠在Morris水迷宮測試中逆反學(xué)習(xí)能力(Wang,Li,et al.,2015),同樣的母嬰隔離顯著降低了大鼠mPFC的BDNF表達(dá),并且二者呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(Wang,Shao,&Wang,2015)。因此我們假設(shè)mPFC的BDNF表達(dá)降低可能參與了水迷宮的逆反學(xué)習(xí)能力增強(qiáng)的神經(jīng)機(jī)制。而本研究的結(jié)果進(jìn)一步支持了這一研究假設(shè)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),mPFC損毀的大鼠仍然能夠?qū)⒛繕?biāo)和環(huán)境信息進(jìn)行空間上的聯(lián)結(jié)(de Bruin,Sànchez-Santed,Heinsbroek,Donker,&Postmes 1994),提示我們mPFC可能并未參與空間信息的加工。在結(jié)合了許多mPFC參與調(diào)節(jié)認(rèn)知功能的研究之后,Lacroix等研究者提出mPFC影響認(rèn)知學(xué)習(xí)并非是通過影響記憶功能本身來實(shí)現(xiàn)的,而主要通過影響注意、識別能力等非記憶認(rèn)知過程來實(shí)現(xiàn)的(Lacroix,White,&Feldon,2002)。 本研究發(fā)現(xiàn)的阻斷 mPFC-TrkB受體顯著提高了大鼠在 Morris水迷宮的逆反學(xué)習(xí)能力并對其空間學(xué)習(xí)能力沒有顯著影響很好的支持了上述觀點(diǎn)。

BDNF可以調(diào)節(jié)大腦的突觸可塑性,并且對于維持 mPFC的功能有著重要作用(Savitz,Solms,&Ramesar,2006),雖然目前并未發(fā)現(xiàn)有阻斷 mPFC-TrkB受體影響動物認(rèn)知靈活性的相關(guān)報(bào)道,但是最近的一項(xiàng)研究表明,溫和應(yīng)激可以增強(qiáng)小鼠的逆反學(xué)習(xí)能力,腹內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)(Ventromedial prefrontal cortex,vmPFC)損毀成功模擬了這種逆反學(xué)習(xí)增強(qiáng)的效果,而vmPFC注射BDNF則阻止了應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠逆反學(xué)習(xí)能力的增強(qiáng)(Graybeal et al.,2011)。這一研究很好的從側(cè)面支持了本研究的結(jié)果。此外,本實(shí)驗(yàn)室之前的研究發(fā)現(xiàn),社會隔離可以導(dǎo)致大鼠 Morris水迷宮中逆反學(xué)習(xí)能力的損傷,同時(shí)伴隨 mPFC-BDNF表達(dá)的增加(Han et al.,2011)。而另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)基因突變導(dǎo)致mPFC過量表達(dá)BDNF的小鼠工作記憶受到了損傷(Papaleo et al.,2011),這些研究也從相反的方向印證了本研究的發(fā)現(xiàn)。綜合以上研究結(jié)果,mPFC內(nèi)的BDNF通路與認(rèn)知靈活性之間可能呈現(xiàn)一定的負(fù)向調(diào)節(jié)關(guān)系,即激活或阻斷分別與認(rèn)知靈活性降低或增高相關(guān),但關(guān)于mPFC-BDNF參與調(diào)節(jié)大鼠學(xué)習(xí)、記憶以及認(rèn)知靈活性功能的神經(jīng)機(jī)制需要我們做更深一步的探究。

5 結(jié)論

本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn),慢性阻斷mPFC-TrkB受體顯著提高了大鼠在 Morris水迷宮測試中的逆反學(xué)習(xí)能力,但是對其空間學(xué)習(xí)能力并沒有顯著影響。同時(shí),慢性阻斷mPFC-TrkB受體對大鼠海馬BDNF的表達(dá)和曠場測試中各種行為也未能產(chǎn)生顯著影響。本研究首次考察了阻斷mPFC-TrkB受體對于大鼠 Morris水迷宮認(rèn)知能力的影響及其潛在的神經(jīng)機(jī)制,對于探索海馬和mPFC在調(diào)節(jié)個體認(rèn)知功能中各自的作用提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論支持。

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