傅靜 譚艷平 劉學(xué)群 王春臺(tái)

摘要：將水稻目地基因Rf6連接到載體PMD-18T上，測(cè)序正確后將目的片段連接到含有GST標(biāo)簽的pGEX-6P-1原核表達(dá)載體上，確認(rèn)正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21菌株;通過LB培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)是否誘導(dǎo)出目的條帶，并且經(jīng)過Glutathione Resin親和層析系統(tǒng)純化及檢測(cè)。結(jié)果表明，20 ℃，4 h，0.3 mmol/L IPTG條件下可誘導(dǎo)出可溶性蛋白，經(jīng)純化得到可溶性帶GST標(biāo)簽的融合蛋白。

關(guān)鍵詞：水稻;恢復(fù)基因（Rf6）;融合蛋白GST-RF6;原核表達(dá)

中圖分類號(hào)：S511;Q78 ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ?文章編號(hào)：0439-8114（2015）23-6047-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.23.064

Prokaryotic Expression，Purification of Fertility Restoration Protein for HL-type Cytoplasmic Male Sterility in Rice

FU Jing， TAN Yan-ping， LIU Xue-qun， WANG Chun-tai

（HuBei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China/Key Lab for Biotechnology of State Ethnic Affairs Commission， College of Life Science， South-Central University for Nationalities， Wuhan 430074， China）

Abstract：To achieve activated fertility restorarion protein in vitro， the gene of rice was cloned into PMD-18T for sequencing. Then the gene was connected with prokaryotic expression vector pGEX-6P-1 containing the GST-tag and the recombinant prokaryotic expression vector was transformed into E.coli strain BL21. The GST-tagged fusion protein was induced with IPTG in E.coli strain BL21，and confirmed by SDS-PAGE and Western Blot analysis. The results showed that of the soluble fusion protein was induced by 0.3 mmol/L IPTG at 20 ℃ for 4 h， was and purified by Glutathione resin.

Key words：rice; Fertility restoration-6（Rf6）; GST-Rf6 fusion protein;prokaryotic expression

細(xì)胞質(zhì)雄性不育（Cytoplasmic male sterility， CMS）不能產(chǎn)生有功能的花粉且具有母性遺傳的特征[1]。CMS是線粒體不育基因和核基因的互作所致[2]。一方面，在高等植物中CMS普遍存在[3-5]，其作為農(nóng)作物雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)，具有極其重要的生產(chǎn)利用價(jià)值;另一方面，它又是研究細(xì)胞質(zhì)遺傳、核質(zhì)互作和花藥發(fā)育的好材料[6]。

三系雜交水稻中，國(guó)際公認(rèn)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育水稻類型主要有包臺(tái)型、紅蓮型和野敗型3種。20世紀(jì)70年代初，武漢大學(xué)[7]采用常規(guī)水稻與野生稻品種互為父母本進(jìn)行大量雜交，培育出紅蓮型雜交水稻。多年來(lái)，紅蓮型雜交水稻已經(jīng)在基礎(chǔ)性研究、應(yīng)用性研究和產(chǎn)業(yè)化等多方面取得了重要進(jìn)展。

Huang等[8]發(fā)現(xiàn)只含有一個(gè)育性恢復(fù)基因Rf5或Rf6的雜交F1代花粉只有50%是正?？捎欢瑫r(shí)含有Rf5和Rf6的群體花粉有75%是正?？捎?duì)F2和BC1F1遺傳群體分析揭示Rf5與Rf6是兩個(gè)非等位基因，Rf6位于第8號(hào)染色體短臂的標(biāo)記RM7037和RM22355之間。Rf5與Rf6分別獨(dú)立恢復(fù)HL-CMS水稻，模式是配子體恢復(fù)模式。

目前，關(guān)于恢復(fù)基因Rf6的表達(dá)模式、相互作用的不育基因以及水稻育性恢復(fù)的分子機(jī)理等問題亟需解決。筆者通過對(duì)水稻Rf6與其同源的PPR序列進(jìn)行比對(duì)后設(shè)計(jì)引物，分離Rf6特異序列，通過基因克隆和原核表達(dá)分離純化其特異蛋白，為探索水稻Rf6的恢復(fù)育性的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試材料 ?植物材料粵泰A（YTA）、9311、大腸桿菌菌株BL21（DE3）和DH5α、原核表達(dá)載體pGEX-6p-1，均由中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 ?主要儀器 ?Centrifuge 5415D、5417R和5810R離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司;CR22G 高速離心機(jī)，購(gòu)自日本Hitachi公司;C1000 Touch Thermal Cycler PCR儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司;DYY-5 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，購(gòu)自北京六一儀器廠;凝膠成像系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Bio-RAD公司;752N型紫外可見分光光度計(jì)，購(gòu)自上海精科公司;Soniprep 150型超聲破碎儀，購(gòu)自日本SANYO公司;Model 1000 型分子雜交箱，購(gòu)自美國(guó)Robbins Scientific Corporation;FB-SDB-2020型半干式轉(zhuǎn)印槽，購(gòu)自美國(guó)Fisher Scientific公司;Gene Genius系統(tǒng)，購(gòu)自英國(guó)SYNOPTICS LTD。

1.1.3 ?主要試劑 ?限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)所需dNTP，rTaq酶，10×PCR Buffer，T載體PMD-18T，蛋白分子量Marker和DNA分子量Marker，T4 DNA 連接酶，皆購(gòu)自于Takara公司;Pageruler Prestained蛋白分子量Marker，購(gòu)自FREMENTAS公司。DNA凝膠回收及清潔試劑盒，購(gòu)自Axygen 公司;GST抗體及二抗，均購(gòu)自南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司;引物及測(cè)序均在武漢擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行。

1.2 ?方法

1.2.1 ?原核表達(dá)中間載體的構(gòu)建 ?從NCBI上數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得Rf6基因序列，以BamHⅠ、EcoRⅠ為接頭設(shè)計(jì)引物，以9311為模板PCR擴(kuò)增目的片段。PCR引物序列為F（5′-CGGGATCCCATGACAAGAGGACCAG-3′），R（5′-CGGAATTCGTTATAAGTGACGACATCCG-3′）。PCR體系：6.7 μL ddH2O，1 μL 10×PCR buffer，0.2 μL引物F（10 μmol/L），0.2 μL引物R（10 μmol/L），0.8 μL dNTP（2.5 mmol/L），1 μL模板DNA，0.1 μL Taq酶（5 U/μL），共10 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s;59 ℃退火30 s;72 ℃延伸90 s，重復(fù)34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)完成后用DNA凝膠回收試劑盒純化產(chǎn)物，連接載體PMD-18T，熱擊轉(zhuǎn)化入宿主菌DH5α，挑取單克隆培養(yǎng)后，利用SDS堿裂解提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)及雙酶切檢測(cè)，將檢測(cè)為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.2 ?原核表達(dá)載體的構(gòu)建 ?將pGEX-6P-1和測(cè)序正確的原核表達(dá)中間載體同時(shí)用BamH Ⅰ、EcoRⅠ雙酶切，37 ℃酶切6 h?；厥占兓┞墩承阅┒说哪康钠魏洼d體，用T4連接酶將二者連接后熱擊轉(zhuǎn)化入宿主菌DH5α，同樣挑取單克隆培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)及雙酶切檢測(cè)。兩種檢測(cè)都正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21（DE3）。

1.2.3 ?重組融合蛋白的表達(dá) ?將轉(zhuǎn)入正確質(zhì)粒的BL21涂布平板，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單菌落接種到液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min，培養(yǎng)過夜。按1∶100的接種量進(jìn)行接種，分別吸取1 mL 菌液接種于9瓶100 mL含Amp的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600 nm≈0.6。加入IPTG 至終濃度為0.7 mmol/L，然后分別于8、20、28、37 ℃振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，在誘導(dǎo)6 h時(shí)取樣10 mL。同時(shí)，培養(yǎng)加IPTG誘導(dǎo)的pGEX-6P-1空載體的BL21菌株和不加IPTG誘導(dǎo)的重組載體的BL21菌株作為陰性對(duì)照。

選取20 ℃，操作同上，分別加入0、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，均在6 h取樣檢測(cè);在20 ℃，IPTG終濃度為0.7 mmol/L，不同時(shí)間2、4、6、9、20 h取樣進(jìn)行檢測(cè)。

重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)：將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液轉(zhuǎn)入離心管中，于5 000 r/min 離心10 min，棄上清菌液，收集菌體，加入1.0 mL PBS（pH 7.4）緩沖液，用槍頭吹打菌體使菌體重懸，在冰浴中超聲波破碎細(xì)胞，破碎10 s，間隔10 s，共破碎5 min;收集混合液后4 ℃， 12 000 r/min離心15 min，收集蛋白上清液。沉淀用Buffer B重懸，在冰上放置1 h，期間輕輕搖晃3～4次，12 000 r/min離心10 min，收集蛋白包涵體。在各個(gè)取樣中加入蛋白質(zhì)Loading buffer，100 ℃沸水中煮8 min，10%SDS-PAGE檢測(cè)。恒壓100 V電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑電泳至膠底部邊緣時(shí)即可停止電泳。

1.2.4 ?重組蛋白的Western Blot檢測(cè) ?將重組質(zhì)粒經(jīng)20 ℃誘導(dǎo)4 h的蛋白上清液與包涵體分別進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

1.2.5 ?純化蛋白檢測(cè) ?誘導(dǎo)蛋白上清液與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（即GST）純化柱4 ℃孵育過夜。利用谷胱甘肽與GST之間酶和底物的特異性作用力，GST標(biāo)簽的融合蛋白能夠與凝膠上的手臂谷胱甘肽結(jié)合。25倍體積PBS洗脫雜蛋白，再用還原型谷胱甘肽將帶標(biāo)簽的融合蛋白洗脫，流出液即為純化蛋白。純化蛋白通過10%SDS-PAGE檢測(cè)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?原核表達(dá)中間載體的構(gòu)建

利用PCR擴(kuò)增得到目的片段，并將目的片段連接PMD-18T載體，經(jīng)PCR鑒定，產(chǎn)物大小為750 bp;質(zhì)粒DNA經(jīng)BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切，結(jié)果顯示原核表達(dá)中間載體經(jīng)過雙酶切得到2 700 bp和750 bp兩條條帶，與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。將構(gòu)建好的載體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證正確。

2.2 ?原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將構(gòu)建好的原核表達(dá)中間載體用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切切下目的片段，并與pGEX-6P-1連接后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。然后用BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切方法檢測(cè)是否插入目的片段，結(jié)果表明3號(hào)和10號(hào)單克隆質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切得到5 000 bp和750 bp兩條條帶，擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期結(jié)果一致（圖2），表明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果證實(shí)序列無(wú)誤，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 ?原核表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化

經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，將誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌進(jìn)行超聲波破碎。用10% SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)染色，可觀察到在40.0～55.0 kD誘導(dǎo)處理后的樣品與未經(jīng)誘導(dǎo)的蛋白間存在明顯的差異，其大小與預(yù)測(cè)的大小相同，表明目的基因在pGEX-6P-1系統(tǒng)中得到了表達(dá)。8 ℃，6 h表達(dá)的蛋白主要存在于包涵體和上清液中，重組蛋白表達(dá)較少。28、37 ℃，6 h表達(dá)的蛋白主要以包涵體的形式存在，同時(shí)在上清液中幾乎沒有重組蛋白存在（圖3）。

選取20 ℃，分別加入0、0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)6 h取樣檢測(cè)（圖4）。沒有IPTG的條件下，蛋白有微弱表達(dá)，隨著IPTG濃度的增加，蛋白表達(dá)量增加。0.5 mmol/L IPTG及以上濃度表達(dá)蛋白主要以包涵體的形式存在，選擇0.3 mmol/L IPTG作為誘導(dǎo)條件。

不同取樣時(shí)間重組融合蛋白SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，2、4 h上清樣和沉淀樣中均有表達(dá)，沉淀樣中的含量比上清樣中多。4 h上清樣中的可溶性蛋白比2 h多。6、9、20 h蛋白主要存在于沉淀中，以包涵體的形式存在（圖5）。

2.4 ?Western Blot檢測(cè)目的蛋白

在20 ℃、4 h、0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下的上清液蛋白和包涵體，以GST的抗體為探針，利用Western Blot進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明（圖6），檢測(cè)得到的蛋白均為融合蛋白，誘導(dǎo)不加IPTG的陰性對(duì)照則沒有檢測(cè)出融合蛋白，pGEX-6P-1空載檢測(cè)出GST標(biāo)簽蛋白，說(shuō)明可溶性蛋白誘導(dǎo)成功。

2.5 ?蛋白純化檢測(cè)

將含有目的融合蛋白的上清液利用10 mmol/L還原型谷胱甘肽進(jìn)行洗脫并純化，通過10% SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖7）顯示，融合蛋白成功純化。

3 ?小結(jié)與討論

雜交稻具有明顯的雜種優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象，主要表現(xiàn)在生長(zhǎng)旺盛、根系發(fā)達(dá)、穗大粒多、抗逆性強(qiáng)等方面[9]。CMS對(duì)于雜交水稻具有重大意義。研究表明，CMS不育主要是由線粒體基因組引起的，而育性恢復(fù)要靠細(xì)胞核基因組中恢復(fù)基因（Rfs）的作用來(lái)實(shí)現(xiàn)[10]。因此，將其分為不育基因和恢復(fù)基因兩方面進(jìn)行研究。純化出可溶性蛋白為恢復(fù)基因和不育基因的體外互作研究提供了可能。

YTA中發(fā)現(xiàn)了不育蛋白ORFH79。Peng等[11]將orfH79在細(xì)菌和酵母中表達(dá)，orfH79對(duì)細(xì)菌和酵母有抑制作用。胡婧等[12]原核表達(dá)水稻HL-CMS中orf216蛋白并制備了抗體。本試驗(yàn)中8 ℃、6 h表達(dá)的蛋白主要存在于包涵體和上清液中，重組蛋白表達(dá)較少。原因可能是溫度比較低，重組蛋白沒有變性，同時(shí)低溫時(shí)菌體繁殖沒有高溫繁殖快，所以出現(xiàn)表達(dá)量較少。28 ℃和37 ℃時(shí)蛋白主要以包涵體的形式存在，原因可能是溫度過高蛋白變性或者是菌體在相對(duì)于8 ℃的高溫大量繁殖，蛋白大量表達(dá)，蛋白正確折疊的效率跟不上表達(dá)的效率。IPTG濃度按最優(yōu)和節(jié)約藥品原則選取0.3 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。本試驗(yàn)純化得到的蛋白可以制備抗體，并用作后續(xù)研究，如RF6蛋白的鑒定，互作蛋白的Pull down試驗(yàn)等。

參考文獻(xiàn)：

[1] YOUNG E G， HANSON M R. A fused mitochondrial gene associated with cytoplasmic male sterility is developmentally regulated[J]. Cell，1987，50（1）：41-49.

[2] FUJII S， TORIYAMA K. Genome barriers between nuclei and mitochondria exemplified by cytoplasmic male sterility[J]. Plant and Cell Physiology，2008，49（10）：1484-1494.

[3] LASER K D， LERSTEN N R. Anatomy and cytology of microsporogenesis in cytoplasmic male sterile angiosperms[J]. The Botanical Review，1972，38（3）：425-454.

[4] MACKENZIE S， HE S， LYZNIK A. The elusive plant mitochondrion as a genetic system[J]. Plant Physiology，1994，105（3）： 775-780.

[5] SCHNABLE P S， WISE R P. The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility restoration[J]. Trends in Plant Science，1998，3（5）：175-180.

[6] 朱英國(guó)，利容千，王明全.水稻雄性不育生物學(xué)[M].武漢：武漢大學(xué)出版社，2000.

[7] LI S Q， YANG D C， ZHU Y G. Characterization and use of male sterility in hybrid rice breeding[J]. J Integr Plant Biol， 2007， 49： 791-804.

[8] HUANG W， HU J， YU C， et al. Two non-allelic nuclear genes restore fertility in a gametophytic pattern and enhance abiotic stress tolerance in the hybrid rice plant[J]. Theoretical and Applied Genetics，2012，124（5）：799-807.

[9] 張朝輝.水稻產(chǎn)量和品質(zhì)雜種優(yōu)勢(shì)研究[J].北京農(nóng)業(yè)，2014（33）：8.

[10] SCHNABLE P S， WISE R P. The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility restoration[J]. Trend Plant Sci， 1998（3）：175-180.

[11] PENG X， WANG K， HU C， et al. The mitochondrial gene orfH79 plays a critical role in impairing both male gametophyte development and root growth in CMS-Honglian rice[J]. BMC Plant Biology， 2010， doi：10.1186/1471-2229-10-125

[12] 胡 ?婧，程 ?鋼，譚艷平，等.水稻HL-CMS中orf216蛋白的原核表達(dá)和多克隆抗體制備[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（3）：257-261.