老年前列腺癌組織中Nedd4L對(duì)TrkA的泛素化調(diào)控

汪治宇郭曉金曹靜

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤免疫科，河北石家莊050000)

摘要〔〕目的探討神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育調(diào)控樣蛋白(Nedd4L)通過(guò)泛素化降解癌蛋白神經(jīng)生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶受體(TrkA)抑制老年前列腺癌的分子作用機(jī)制。方法收集手術(shù)切除的43例老年前列腺癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本。免疫組化染色檢測(cè)Nedd4L及TrkA的表達(dá)，在人前列腺癌LNCaP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Nedd4L特異性siRNA后，采用qRT-PCR及Western印跡檢測(cè)LNCaP細(xì)胞內(nèi)TrkA mRNA及蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果Nedd4L蛋白在老年前列腺癌組織中表達(dá)明顯降低，而TrkA表達(dá)顯著升高(P<0.05)；二者呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，Nedd4L的表達(dá)降低與TrkA表達(dá)升高均與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高TNM分期顯著相關(guān)(P<0.05)；在體外，下調(diào)Nedd4L表達(dá)后可顯著升高TrkA蛋白的表達(dá)水平(P<0.05)，而對(duì)TrkA mRNA表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05)。結(jié)論Nedd4L及TrkA在老年前列腺癌組織中異常表達(dá)，Nedd4L可能通過(guò)泛素化降解癌蛋白TrkA實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用。

關(guān)鍵詞〔〕Nedd4L； TrkA；前列腺癌；泛素化

中圖分類號(hào)〔〕R737.25〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81202037)

第一作者：汪治宇(1979-)，男，副主任醫(yī)師，副教授，博士，主要從事腫瘤免疫學(xué)研究。

神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育調(diào)控樣蛋白(Nedd4L)定位于人類染色體18q21.31上，是Nedd4家族中的一員，在腦、心臟、肺及腎臟等多種組織器官中都有表達(dá)〔1，2〕，作為一種HECT類E3泛素連接酶，它對(duì)EGFR、TGFβ及Wnt等多種蛋白及信號(hào)通路都有調(diào)節(jié)作用〔3~5〕，在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌及胃癌等多種人類惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失，并與腫瘤惡性病理學(xué)特征及不良預(yù)后相關(guān)。神經(jīng)生長(zhǎng)因子酪氨酸激酶受體(Trk)A是神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)的高親和力功能性受體。NGF與TrkA結(jié)合后能夠在細(xì)胞膜上形成二聚體進(jìn)而使TrkA胞內(nèi)段的酪氨酸基因發(fā)生磷酸化，并活化下游Ras /PI3K/Akt 途徑抑制凋亡蛋白的活化〔6〕。因而，TrkA在促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及腫瘤耐藥中具有關(guān)鍵作用。本課題通過(guò)體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)探究Nedd4L在前列腺癌中的抗腫瘤作用及其分子機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料本課題經(jīng)我院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)后開(kāi)展。收集2013年1月至2014年5月在我院泌尿外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的前列腺癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織(距切緣>2 cm)標(biāo)本43例，年齡62~79歲，中位年齡67歲。所有入組患者均簽署知情同意文件，術(shù)前均未行放化療。所有標(biāo)本在切除后30 min內(nèi)取材2份，分別置入40 g/L多聚甲醛溶液或液氮中保存。RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(#1622)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit(RR037A)Real time PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，RNA提取試劑TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Nedd4L引物(正義5′-ACAGT CTCATGTTTGATGCTTCGT-3′，反義：5′-AGAAGGCTGAAATGAA GCACGT-3′)，TrkA引物(正義 5′-ATCGT GAAGAGTGGT CTCCGTTT-3′，反義：5′-GAGAGAGACTCCAGAGCGTTGAA-3′)，GA PDH引物(正義：5'-ACCCACTCCTCCACCTTTGA-3'，反義：5'-CT GTTGCTGTAGCCAAATTCGT-3')由上海生工生物科技有限公司合成；人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP購(gòu)自中科院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物研究所；胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；1×DMEM液體細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Mediatech公司；Trizol試劑及脂質(zhì)體2000(lipofectamineTM2000)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Nedd4L特異性siRNA及陰性對(duì)照(NC)siRNA、兔抗人Nedd4L多克隆抗體sc-85081、兔抗人TrkA多克隆抗體sc-20539及小鼠抗人β-actin單克隆抗體sc-47778均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自Milipore公司。

1.2方法

1.2.1免疫組化檢測(cè)前列腺癌組織中Nedd4L與TrkA的表達(dá)組織標(biāo)本脫水、石蠟包埋后，自動(dòng)切片機(jī)制作4 μm厚組織切片。切片經(jīng)二甲苯及梯度酒精脫蠟、水化后，于pH6.0枸櫞酸緩沖液進(jìn)行抗原熱修復(fù)；3% H2O2水溶液阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；10%山羊血清封閉后分別滴加兔抗人Nedd4L抗體(1∶100)及兔抗人TrkA抗體(1∶100)，4℃孵育過(guò)夜；洗去多余一抗后，加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min；洗去殘余未結(jié)合二抗，滴加辣根過(guò)氧化物酶-鏈酶卵白素復(fù)合物進(jìn)行反應(yīng)，DAB顯色、蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。每張切片由2位高年資病理醫(yī)師，在高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取10個(gè)視野，按以下標(biāo)準(zhǔn)〔7〕單獨(dú)閱片、評(píng)分：染色強(qiáng)度評(píng)分：0分：陰性；1分：弱陽(yáng)性；2分：中度陽(yáng)性；3分：強(qiáng)陽(yáng)性。陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞(或腺細(xì)胞)百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞≤5% 為0分；6%~25% 為1分；26%~50% 為2分；51% ~75% 為3分；75% 為4分。每視野評(píng)分=染色強(qiáng)度評(píng)分×陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞(或腺細(xì)胞)百分比評(píng)分，取10個(gè)視野的平均得分作為最終評(píng)分。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)LNCaP細(xì)胞株培養(yǎng)于含100 ml/L FBS的1×DMEM培養(yǎng)基中，37℃、50 ml/L CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。穩(wěn)定傳代2~3代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞接種于6孔板中，采用含100 ml/L FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至匯合度達(dá)50%左右后，實(shí)驗(yàn)組每孔加入100 pmol/L Nedd4L特異性siRNA及5 μl LipofectamineTM2000；對(duì)照組每孔加入100 pmol/L NC siRNA及5 μl LipofectamineTM2000。每孔加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整終體積至2 ml，置于37℃、50 ml/L CO2、飽和濕度下培養(yǎng)6 h后，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4qRT-PCR檢測(cè)Nedd4L與TrkA mRNA的表達(dá)按TRIzol試劑說(shuō)明書提取組織總RNA，按如下條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：70℃預(yù)變性5 min，37℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1 h，85℃反應(yīng)5 min。取2 μl cDNA按Real-time PCR試劑說(shuō)明書配制PCR體系，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s,95℃變性5 s,60℃退火延伸30 s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算Nedd4L與TrkA mRNA的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5Western印跡法檢測(cè)Nedd4L與TrkA蛋白的表達(dá)收集轉(zhuǎn)染72 h后的LNCaP細(xì)胞，加入RIPA裂解液置冰上裂解10 min，裂解液收集于1.5 ml EP管中，4℃、14 000 r/min離心10 min后取上清。BCA法測(cè)定總蛋白濃度，每孔加入50 μg蛋白樣品，100 g/L SDS-PAGE分離蛋白。采用BIO-RAD半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，20 V轉(zhuǎn)膜1 h，50 g/L BSA室溫封閉1.5 h；加入兔抗人Nedd4L抗體(1∶1 000)、兔抗人TrkA抗體(1∶1 000)及小鼠抗人β-actin抗體(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，0.01 mol/L TBST漂洗5 min×3次，分別加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h。0.01 mol/L TBST漂洗5 min×3次。于暗室內(nèi)，在膜上滴加ECL溶液，并使膠片曝光，全自動(dòng)洗片機(jī)洗片。

2結(jié)果

2.1Nedd4L及TrkA蛋白在前列腺癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)腫瘤組織中Nedd4L的陽(yáng)性表達(dá)率為25.58%(11/43)，TrkA的陽(yáng)性表達(dá)率為72.09%(31/43)。但在對(duì)應(yīng)癌旁組織中Nedd4L陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)67.44%(29/43)，TrkA陽(yáng)性表達(dá)率僅為16.28%(7/43)。Pearsonχ2檢驗(yàn)顯示，Nedd4L及TrkA在癌組織與正常組織中表達(dá)水平有顯著性差異(P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1　Nedd4L及TrkA蛋白在前列腺癌及癌旁組織中 陽(yáng)性表達(dá)(×400)

2.2Nedd4L及TrkA蛋白表達(dá)與前列腺癌臨床病理特征的相關(guān)性分析腫瘤組織中 Nedd4L蛋白的陰性表達(dá)及TrkA蛋白的陽(yáng)性表達(dá)均與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及高TNM分期呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1Nedd4L及TrkA表達(dá)與前列腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系(n)

項(xiàng)目nNedd4L陰性表達(dá)χ2值P值TrkA陽(yáng)性表達(dá)χ2值P值良性前列腺增生 有26190.9510.329211.4910.222 無(wú)171010總前列腺特異性抗原 ≤10ng/ml11102.4100.12161.2420.265 >10ng/ml321925病理分級(jí) G1~G220162.6860.101122.7180.099 G3231319淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 有27226.5140.027234.5570.033 無(wú)1678TNM分期 Ⅰ+Ⅱ期21107.3450.007124.5600.033 Ⅲ+Ⅳ期221919

2.3Nedd4L及TrkA蛋白在前列腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析Spearman相關(guān)性分析證實(shí)二者表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.834,P<0.05)。

2.4Nedd4L siRNA轉(zhuǎn)染人前列腺癌LNCaP細(xì)胞將Nedd4L特異性siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入人前列腺癌LNCaP細(xì)胞中，采用qRT-PCR及Western印跡檢測(cè)Nedd4L siRNA的干擾效果，結(jié)果顯示Nedd4L siRNA組Nedd4L mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著低于陰性對(duì)照(NC)組(P<0.05，圖2)。

圖2　不同siRNA轉(zhuǎn)染LNCaP細(xì)胞后Nedd4L及 TrkA蛋白表達(dá)

2.5敲低Nedd4L對(duì)TrkA表達(dá)的影響敲低Nedd4L 表達(dá)后TrkA mRNA的表達(dá)水平較NC組無(wú)明顯改變(1.000 vs 0.901±0.006，P>0.05)，而TrkA蛋白質(zhì)的表達(dá)水平則顯著下降(P<0.05，圖2)。

3討論

目前，根治性手術(shù)及術(shù)后規(guī)范放、化療是治療前列腺癌的主要方法〔8〕，但前列腺癌早期診斷困難、易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移等原因常導(dǎo)致患者就診時(shí)已失去根治性手術(shù)機(jī)會(huì)。近年來(lái)，以阿比特龍(abiraterone)為代表的內(nèi)分泌治療及以伊匹單抗(ipilimumab)和德尼單抗(Dnosumab)為代表的分子靶向治療在前列腺癌的治療中顯現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)。

近年來(lái)，許多學(xué)者都進(jìn)行了Nedd4L及TrkA與腫瘤的相關(guān)性研究。Tanksley等〔9〕在結(jié)腸癌中的研究發(fā)現(xiàn)，Nedd4L的mRNA及蛋白水平在各分期的結(jié)腸癌組織中均較正常結(jié)腸組織顯著降低，并與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)；在體外，過(guò)表達(dá)Nedd4L可明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中Wnt信號(hào)通路的活化。對(duì)大樣本的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在腎上腺癌、胰腺癌、卵巢癌及膀胱癌等人類惡性腫瘤中均存在TrkA的表達(dá)上調(diào)。在體外，利用藥物降低TrkA的表達(dá)后可顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤IMR-32細(xì)胞的侵襲能力及裸鼠皮下成瘤體積。本研究提示Nedd4L與TrkA的異常表達(dá)可能在前列腺癌增殖和轉(zhuǎn)移的生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解主要包括溶酶體途徑及泛素化途徑，其中，泛素途徑是通過(guò)泛素激活酶(E1)、泛素結(jié)合酶(E2)及泛素連接酶(E3)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)后，蛋白與多個(gè)泛素分子共價(jià)結(jié)合后被蛋白酶體復(fù)合物識(shí)別并降解，釋放出來(lái)的泛素分子可循環(huán)使用。本研究結(jié)果提示Nedd4L可能對(duì)TrkA的表達(dá)存在調(diào)控作用。在神經(jīng)細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，Nedd4L能夠通過(guò)泛素化修飾作用降解PC12細(xì)胞中的TrkA蛋白，削弱NGF與TrkA結(jié)合，進(jìn)而影響PLCγ與 ERK1/2、MAPK信號(hào)通路的活化。作為一種E3泛素連接酶，Nedd4L可能通過(guò)泛素化作用降解細(xì)胞內(nèi)TrkA蛋白。根據(jù)本文結(jié)果推斷，在前列腺癌中Nedd4L通過(guò)泛素化途徑在蛋白質(zhì)層面對(duì)TrkA實(shí)現(xiàn)調(diào)控作用。

綜上所述，Nedd4L與TrkA在前列腺癌中存在異常高表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤惡性臨床病理學(xué)特征顯著相關(guān)。Nedd4L可能通過(guò)泛素化降解癌蛋白TrkA，在蛋白質(zhì)層面發(fā)揮其抗腫瘤作用。

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〔2013-12-09修回〕

(編輯李相軍)