肺腺癌A549細(xì)胞KDR基因沉默后對(duì)厄羅替尼敏感性的影響

張秀義勾建強(qiáng)

(承德市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，河北承德067000)

摘要〔〕目的研究激酶功能區(qū)受體(KDR)基因沉默對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖和對(duì)化療藥物厄羅替尼敏感性的影響。方法設(shè)計(jì)合成KDR的siRNA序列，LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染人A549細(xì)胞。RT-PCR和Western印跡檢測(cè)KDR在干擾后mRNA和蛋白的表達(dá)情況，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。MTT法和細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)觀察KDR基因沉默后A549細(xì)胞對(duì)厄羅替尼的敏感性。結(jié)果KDR基因沉默48 h后，A549細(xì)胞的KDR基因和蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。KDR基因沉默組細(xì)胞對(duì)厄羅替尼的敏感性顯著性增強(qiáng)。結(jié)論KDR特異性siRNA能顯著沉默A549細(xì)胞KDR基因，抑制細(xì)胞增殖，并增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)厄羅替尼的敏感性。

關(guān)鍵詞〔〕激酶功能區(qū)受體(KDR)； siRNA； 肺腺癌；A549細(xì)胞；厄羅替尼

中圖分類(lèi)號(hào)〔〕R734.2〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A〔

第一作者：張秀義(1977-)，女，主治醫(yī)師，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究。

肺腺癌是肺癌一種組織學(xué)類(lèi)型，發(fā)病率逐年上升,發(fā)病年齡也逐漸年輕化，早期可出現(xiàn)淋巴或血行轉(zhuǎn)移，對(duì)放化療不敏感，嚴(yán)重制約肺腺癌5年生存率〔1，2〕。腫瘤的增殖與基因調(diào)控有關(guān)，為臨床醫(yī)生提供了新的有效治療腫瘤途徑〔3〕。研究表明肺腺癌細(xì)胞的發(fā)病、侵襲、轉(zhuǎn)移涉及許多基因的激活、失活〔4〕。研究發(fā)現(xiàn)〔5〕激酶功能區(qū)受體(KDR)基因在肺腺癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，可作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。在肺腺癌綜合治療過(guò)程中化療占有重要的位置，厄羅替尼是肺腺癌最常用、最有效的化療藥物之一〔6〕。本研究探討KDR基因沉默對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖的影響，并與厄羅替尼聯(lián)用后增強(qiáng)人肺腺癌A549細(xì)胞對(duì)厄羅替尼的敏感性。

1材料與方法

1.1主要材料肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞究所。RPMI1640培養(yǎng)液、胰蛋白酶和胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；RT-PCR兩步法試劑盒(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司)， cDNA合成試劑盒(日本TOYOBO公司)；AMV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州博日)；厄羅替尼(Erlotinib，商品名特羅凱)由羅氏公司惠贈(zèng)；siRNA基因片段由上海吉瑪化學(xué)公司合成；G418購(gòu)自美國(guó)Klontech公司；KDR鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；5%四甲基偶氮唑藍(lán)、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自北京中杉公司；厄羅替尼(AstraZeneca UK Limited)；流式細(xì)胞儀(COULTER XL;Coulter)；550酶標(biāo)儀(美國(guó)Biorad公司)，生物倒置顯微鏡(Olympus CKX4)。電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；放射免疫測(cè)定(RIPA)蛋白裂解液購(gòu)自江蘇碧云天公司。

1.2siRNA設(shè)計(jì)、合成及轉(zhuǎn)染依據(jù)文獻(xiàn)〔7〕KDR siRNA和陰性對(duì)照組 siRNASCR(scramble siRNA)序列分別為：5'-GCCACCAUGUUCUCUAAUA'I’I'-3’(正義鏈)5'-UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT-3’(反義鏈)；5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU'IT-3’(正義鏈)，5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATI’-3’(反義鏈)。均由上海吉瑪化學(xué)公司合成，MGC-803細(xì)胞培養(yǎng)于含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液(37℃恒溫、5%CO2、飽和濕度)中培養(yǎng)。每3~4 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。按1×105個(gè)/孔將胃癌MGC-803接種于24孔板中，當(dāng)融合率達(dá)70%時(shí)以脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)分為3組：轉(zhuǎn)染pGenesil-1-KDR-siRNA載體者為A549/KDR-siRNA組(實(shí)驗(yàn)組)，轉(zhuǎn)染隨機(jī)對(duì)照載體者為A549/control組(對(duì)照組)，未轉(zhuǎn)染的肺腺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞為A549組(空白組)。于轉(zhuǎn)染后48 h行RNA干擾效應(yīng)的檢測(cè)。

1.3RT-PCR檢測(cè)棄培養(yǎng)液后PBS沖洗細(xì)胞3次，用TRIzol法提取總RNA，通過(guò)cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。分別擴(kuò)增KDR和內(nèi)參GAPDH。KDR上游引物：5’-CTGGCATGGTCTFCTGTGAAGCA-3’，下游引物：5’-AATACCAGTGGATGTGATGCGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物795 bp；內(nèi)參照GAPDH上游引物：5’-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3’，下游引物：5’TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為509 bp。PCR反應(yīng)條件為94℃變性2 min，按94℃變性45 s、62℃退火1 min、72℃延伸1 min進(jìn)行反應(yīng)，循環(huán)35次，再于72℃延伸8 min。2%瓊脂糖水平板電泳，100 V電壓電泳45 min。用凝膠自動(dòng)成像及分析系統(tǒng)(法國(guó)VI)進(jìn)行吸光度掃描,用KDR吸光度/GAPDH吸光度值作為mRNA表達(dá)的相對(duì)強(qiáng)度。

1.4Westem印跡檢測(cè)細(xì)胞棄培養(yǎng)液后PBS沖洗3次，加入預(yù)冷的RIPA裂解液150 μl，RIPA裂解液預(yù)先加PMSF 1.5 μl使其終濃度為1 mmol/L。操作在冰上進(jìn)行， 4℃下，10 000 r/min離心5 min后取上清液，通過(guò)BCA法測(cè)蛋白濃度后，99 ℃ 變性10 min。取50 μg蛋白行10%SDS-PAGE電泳，通過(guò)電轉(zhuǎn)移印跡到PVDF膜上，封閉液中孵育1 h加入1∶1 000稀釋的KDR一抗，4℃過(guò)夜。TBST洗膜5 min,共3次，加入1∶5 000 HRP標(biāo)記的二抗和GAPDH,于37℃孵育2 h PBS洗滌，采用ECL法檢測(cè)。

1.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 收集3組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/L，冷PBS 洗滌2 次,加入70 %的冷乙醇(4℃) 固定24 h后，洗滌細(xì)胞，與含10 μg/ml RNA 酶的Tris-HCl緩沖液(pH7.4) 共同孵育30 min。50 μg/ml 碘化丙啶(PI)進(jìn)行細(xì)胞的DNA 染色，1 h 內(nèi)通過(guò)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞的DNA含量分布，并計(jì)算出各個(gè)周期細(xì)胞所占的百分率。

1.6MTT檢測(cè)干擾KDR后A549對(duì)厄羅替尼的敏感性 細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒48 h后，收集轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞， 接種于96孔板， 每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔， 當(dāng)細(xì)胞貼壁后，加入不 同濃度的厄羅替尼(10、25、50、100、200 μmol/L)培養(yǎng)48 h ；每孔加MTT 20 μl(濃度為5 mg/ml)，放置孵箱內(nèi)4 h后棄上清加入10%的十二烷基磺酸鈉(SDS)200 μl，過(guò)夜。震蕩15 min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的吸光度值(A值)。抑制率(%)=(A對(duì)照-A實(shí)驗(yàn))/(A對(duì)照-A空白)×100%。

1.7平板克隆檢測(cè)干擾KDR后A549對(duì)厄羅替尼的敏感性細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒48 h后，收集轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞， 接種于6孔板 ， 每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔， 細(xì)胞貼壁后，加入不 同濃度的厄羅替尼(10、25、50、100、200 μmol/L)培養(yǎng)中培養(yǎng)7 d，去除培養(yǎng)液，PBS洗2次，95%乙醇固定10 min，吉姆薩染液染色10 min，自來(lái)水沖洗后，晾干，通過(guò)Quantity One軟件計(jì)算克隆數(shù)?？寺⌒纬梢种坡?%)=1-(實(shí)驗(yàn)組克隆數(shù)/對(duì)照組克隆數(shù))×100%。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2結(jié)果

2.1siRNA抑制KDR mRNA的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組條帶明顯變窄，實(shí)驗(yàn)組KDR mRNA表達(dá)(0.28±0.06)與對(duì)照組(0.56±0.07)和空白組(0.57±0.08)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.2siRNA抑制KDR蛋白的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組條帶明顯變窄， 實(shí)驗(yàn)組KDR蛋白灰度值(0.32±0.06)與對(duì)照組(0.71±0.08)和空白組(0.70±0.09)差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1　A549細(xì)胞中KDR mRNA和蛋白的表達(dá)

2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期G0/G1期實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組和空白組明顯增加，S期明顯減少(P<0.05)，3組M期細(xì)胞無(wú)明顯變化(P>0.05)。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組有明顯的S期阻滯。見(jiàn)表1，圖2。

圖2　流式細(xì)胞儀分析A549細(xì)胞的細(xì)胞周期

組別G0/G1期S期G2/M期空白組58.3±3.733.7±3.37.8±1.7對(duì)照組58.2±3.933.8±4.28.6±1.4實(shí)驗(yàn)組70.3±5.61)20.9±3.61)9.3±2.1

和空白組、對(duì)照組比較：1)P<0.05；下表同

2.4干擾KDR后A549對(duì)厄羅替尼的敏感性提高轉(zhuǎn)染pgsiRNA-KDR后，A549細(xì)胞對(duì)不同濃度的厄羅替尼敏感性均提高。隨著藥物濃度的增加，厄羅替尼對(duì)細(xì)胞的抑制率也增加，呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)不同濃度的厄羅替尼敏感性顯著高于對(duì)照組和空白組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

厄羅替尼濃度(μmol/L)空白組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組1016.34±1.5716.23±1.4526.45±1.351)2522.67±1.3423.23±1.6337.24±1.351)5030.85±2.2331.52±1.3650.45±3.021)10040.45±3.2341.65±2.2878.52±2.361)20050.45±3.8050.42±3.2491.42±4.681)

2.5對(duì)A549細(xì)胞集落形成的影響轉(zhuǎn)染 pgsiRNA-KDR后，A549細(xì)胞對(duì)不同濃度的厄羅替尼敏感性均提高，細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯減少，克隆形成抑制率明顯增高(P<0.05)。隨著藥物濃度的增加，厄羅替尼對(duì)細(xì)胞的克隆形成抑制率也增加，呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞對(duì)不同濃度的厄羅替尼克隆形成抑制率顯著高于對(duì)照組和空白組(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

厄羅替尼濃度(μmol/L)空白組對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組1026.12±1.2326.57±1.6334.45±1.631)2536.42±1.3236.85±1.2546.72±1.611)5046.52±2.3246.42±2.5257.73±2.641)10056.42±2.0156.35±2.6567.52±2.341)20067.32±2.5468.42±2.5279.64±2.531)

3討論

肺腺癌作為一種全身性疾病，早期可出現(xiàn)淋巴或血行轉(zhuǎn)移，發(fā)病率呈逐年上升、發(fā)病年齡呈逐漸年輕化的趨勢(shì)〔1〕。目前國(guó)內(nèi)外臨床醫(yī)生對(duì)肺腺癌患者主要采去手術(shù)治療、化療、放療、內(nèi)分泌治療、生物分子靶向治療等綜合治療方案，但其復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移仍然是目前臨床醫(yī)生面臨的巨大難題。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成及功能基因?qū)W的不斷發(fā)展，目前腫瘤基因治療成為科研上研究熱點(diǎn)，并且在腫瘤綜合治療上基因治療得到了醫(yī)學(xué)界廣泛的重視〔7〕。肺腺癌細(xì)胞增殖與眾多基因結(jié)構(gòu)、功能異常有關(guān)，明確肺腺癌發(fā)病中的關(guān)鍵基因?qū)εR床上預(yù)防、診斷及治療肺腺癌具有重大意義〔8〕。

近些年來(lái)隨著RNA干擾技術(shù)的不斷發(fā)展，其已經(jīng)成為腫瘤基因治療中的研究熱點(diǎn)，由dsRNA分子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后沉默基因，具有高效、特異的抑制與腫瘤發(fā)病及耐藥有關(guān)的多種基因表達(dá)的特點(diǎn)，廣泛用于腫瘤、基因等疾病研究，開(kāi)辟了有效治療腫瘤新路徑〔9〕。KDR廣泛分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞，在血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)分化中起重要作用，具有增加血管通透性、促進(jìn)新生血管生成和血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的作用，成為近年來(lái)熱點(diǎn)研究對(duì)象〔5，10〕。通常情況下血管內(nèi)皮細(xì)胞更新緩慢，但在腫瘤組織中的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖活躍，KDR高表達(dá)，介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在腫瘤新生血管中形成〔11，12〕。在肺腺癌的綜合治療中化療占有重要的地位，化療在肺腺癌的綜合治療中占有重要位置，肺腺癌最常用、最有效的化療藥物是厄羅替尼〔6，13〕。本研究提示，KDR基因沉默導(dǎo)入肺腺癌A549細(xì)胞內(nèi),特異性干擾KDR 基因表達(dá)能夠有效抑制人肺腺癌細(xì)胞增殖并對(duì)厄羅替尼的化療敏感性顯著性增強(qiáng)，KDR的siRNA序列為治療人肺腺癌提供了新的理論依據(jù)〔14〕。KDR基因沉默及厄羅替尼兩者結(jié)合，能在一定程度上有效誘發(fā)人肺腺癌A549細(xì)胞的自發(fā)凋亡及提高其對(duì)化療藥物厄羅替尼的敏感性。

綜上，KDR siRNA可以顯著沉默A549細(xì)胞KDR基因和蛋白的表達(dá)，抑制人肺腺癌A549細(xì)胞增殖，顯著影響人肺腺癌A549細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，與厄羅替尼聯(lián)用，具有明顯的協(xié)同效應(yīng)，增強(qiáng)人肺腺癌A549細(xì)胞對(duì)厄羅替尼的化療敏感性。

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〔2013-12-17修回〕

(編輯苑云杰)

·心腦血管、代謝性疾病·