甘草體外抗呼吸道合胞病毒的作用及機制

黃筱鈞1

(湖北民族學院醫(yī)學院，湖北恩施445000)

摘要〔〕目的探討甘草體外抗呼吸道合胞病毒(RSV)的作用及初步機制。方法采用細胞病變效應(CPE)和MTT法，測定細胞半數(shù)中毒濃度(TC50)、藥物半數(shù)抑制濃度(IC50)和抗病毒指數(shù)(TI)，以利巴韋林為對照，評價甘草抗RSV的效果。結果甘草在體外既能抑制RSV的增殖，又能直接殺傷RSV，阻斷RSV的感染。甘草的TC50=3.21 mg/ml，IC50=0.273 mg/ml，TI=11.76。甘草比利巴韋林毒性小，抗病毒指數(shù)大，安全范圍大，抗RSV作用與利巴韋林相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論甘草使用安全，在體外對RSV有明顯的抑制作用。

關鍵詞〔〕甘草；呼吸道合胞病毒；抗病毒作用

中圖分類號〔〕R373.1；R285.5〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學基金(No.81360654)

1四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院

第一作者：黃筱鈞(1979-)，男，講師，主要從事分子病毒學和抗病毒中藥研究。

Experimental study of anti-respiratory syncytial virus effect of Radix Glycyrrhizae in vitro

HUANG Xiao-Jun.

School of Medicine, Hubei Minzu University, Enshi 445000,Hubei,China

Abstract【】ObjectiveTo study the effect of anti-respiratory syncytial virus (RSV)with Radix Glycyrrhizaet and the preliminary mechanism in vitro .MethodsThe antiviral activity of Radix Glycyrrhizae was tested with ribavirin as the positive control. Virus cytopathic effect (CPE) and methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) method were used to measure half toxic concentration (TC50), half inhibitive concentration (IC50)and therapeutic index(TI).ResultsRadix Glycyrrhizae inhibited RSV infection in vitro. The TC50, IC50, TI were 3.21,0.273 mg/ml, 11.76 respectively. Radix Glycyrrhizae had small toxicity, large antiviral index and security range . The anti-RSV role was similar to the same dose of ribavirin(P>0.05).ConclusionsRadix Glycyrrhizae has a significant anti-RSV effect in vitro.

【Key words】Radix Glycyrrhizae ; Respiratory syncytial virus; Antiviral effect

甘草為豆科類植物，其主要有效成分是三萜皂苷類、黃酮類、生物堿和多糖，具有清熱解毒、潤肺止咳之功效，有解毒和祛痰作用。呼吸道合胞病毒(RSV)屬于副黏病毒科肺炎病毒屬，是引起3歲以下小兒呼吸道感染最重要的病原體，也是誘發(fā)嬰兒早期喘息及毛細支氣管炎的最常見病毒，同時也是導致免疫抑制人群和老年人群呼吸道感染和死亡的重要原因〔1，2〕。已有研究證實甘草黃酮具有明顯的抗氧化、抗炎和抗變態(tài)反應、抗?jié)?、?zhèn)痛、抗菌、抗腫瘤和較好的止癢作用〔3，4〕。本實驗以人咽喉癌上皮細胞Hep-2細胞為細胞模型，對甘草醇提液體外抗RSV作用進行研究，并初步探討其機制。

1材料與方法

1.1藥物甘草購于恩施藥材公司，為恩施道地藥材，實驗制備甘草醇提液1.0 g/ml，冷藏備用。利巴韋林注射液(100 mg/ml)，貴州天地藥業(yè)責任有限公司生產(chǎn)(批號H20067579)。

1.2病毒RSV Long株，由四川大學華西醫(yī)學中心提供。

1.3細胞Hep-2細胞為四川大學華西醫(yī)學中心微生物學教研室保存。細胞生長液為10%FBS MEM液，細胞維持液為2%FBS MEM液。

1.4甘草的細胞毒性測定Hep-2細胞傳代3次，生長呈單層，調(diào)整密度為1.0×104/ml。將甘草原液用細胞維持液倍比稀釋，濃度為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/ml，分別接種于Hep-2單層細胞中，0.1 ml/孔，每一稀釋濃度重復4孔。用細胞維持液作為陰性對照，利巴韋林作陽性對照，37℃、5%CO2培養(yǎng)，每天觀察細胞病變效應(CPE)采用MTT法，570 nm波長下測定吸光度(A值)。計算細胞存活率、甘草致細胞半數(shù)中毒濃度(TC50)。細胞存活率=(藥物組平均A值/細胞對照組平均A值)×100%。

1.5RSV的毒力測定將RSV作10倍系列稀釋，將不同稀釋度的RSV接種于Hep-2單層細胞(0.1 ml/孔)，每一稀釋度重復4孔，對照組Hep-2細胞加維持液，37℃、5%CO2孵育2 h，換細胞維持液。每天觀察并記錄CPE至CPE不再進展。按照Reed-Muench法計算病毒的半數(shù)細胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)。

1.6甘草體外抗RSV作用

1.6.1甘草對RSV生物合成的影響將100TCID50RSV接種于Hep-2細胞(0.1 ml/孔)，37℃、5%CO2孵育2 h，用細胞生長液洗3次，洗去未結合的病毒。加入不同濃度的含藥維持液(0.1 ml/孔)，37℃、5%CO2孵育72 h。采用MTT法測定藥物作用于感染細胞后的病毒抑制率，計算甘草對RSV致Hep-2 CPE產(chǎn)生50%抑制的濃度，即藥物的半數(shù)有效濃度(IC50)和抗病毒指數(shù)(TI)。TI=TC50/IC50。病毒抑制率=(實驗組平均A值-病毒對照組平均A值)/(藥物組平均A值-病毒對照組平均A值)×100%。

1.6.2甘草對RSV吸附的影響將不同濃度的甘草加入含單層Hep-2細胞的96孔板上，37℃吸附90 min，棄去上清液，用細胞生長液洗3次，加入100TCID50RSV，滴加細胞維持液1.0 ml/孔，37℃吸附90 min，棄去上清液，加細胞維持液，37℃、5%CO2中培養(yǎng)。逐日觀察細胞生長情況，記錄CPE。

1.6.3甘草對RSV的直接殺傷作用將不同濃度的甘草與100TCID50RSV等量混合后于37℃作用1 h，將混合液分別接種至長滿單層Hep-2細胞的96孔培養(yǎng)板上(0.2 ml/孔)，37℃孵育1 h，用細胞培養(yǎng)液洗3次，洗去未結合的病毒及藥物，再加細胞維持液1.0 ml，37℃、5%CO2培養(yǎng)72 h。每日觀察細胞生長情況。

2結果

2.1甘草的細胞毒性甘草致Hep-2細胞CPE表現(xiàn)為細胞皺縮，形態(tài)改變，胞質(zhì)顆粒增多，折光性增強。96 h后Hep-2細胞脫落，懸浮在培養(yǎng)液表面。隨著甘草液濃度的增加，對Hep-2細胞的毒性增強，細胞存活率下降。MTT法測定甘草和利巴韋林的TC50分別為3.21 mg/ml和 0.293 mg/ml。甘草對細胞的毒性比利巴韋林小。

2.2RSV的毒力正常Hep-2細胞呈梭形，RSV接種于Hep-2細胞后第2天出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為細胞呈圓形或橢圓形，細胞壁增厚，折光性增強，但仍可貼壁。Reed-Muench法計算RSV的TCID50為10-8/0.1ml。本實驗病毒攻擊濃度為100TCID50。

2.3甘草對RSV生物合成的影響甘草實驗組CPE程度均低于病毒對照組，說明甘草對RSV在細胞內(nèi)的增殖具有抑制作用。在濃度0.05～6.4 mg/ml時，隨著甘草液濃度的增加，抗病毒活性增強，CPE特征逐漸減弱，細胞存活率升高，但濃度繼續(xù)增大后甘草對病毒生物合成的抑制率下降(見圖1)。經(jīng)Probit回歸法計算，甘草抑制RSV的IC50=0.273 mg/ml，比TC50值小，TI為11.76。利巴韋林IC50=0.035 8 mg/ml，TI為8.18。甘草比利巴韋林的安全性高，使用安全范圍大，甘草與利巴韋林在抗RSV作用方面差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4甘草抗RSV吸附作用甘草濃度為0.4 mg/ml時Hep-2細胞CPE可達到50%，1.6 mg/ml時CPE將達到25%，說明甘草能阻斷RSV與細胞的吸附，抑制病毒對細胞的破壞作用。見表1。

圖1　甘草對RSV生物合成的影響

2.5甘草對RSV的直接殺傷作用甘草濃度在0.8 mg/ml以上時細胞生長良好，排列規(guī)則，衰老細胞少；而病毒對照組出現(xiàn)明顯的CPE，75%細胞出現(xiàn)CPE時細胞內(nèi)顆粒物增多，細胞變大，碎裂、脫落，說明甘草對RSV具有直接殺傷作用。見表1。

甘草藥物濃度(mg/ml)抑制吸附直接殺傷利巴韋林 藥物濃度 (mg/ml)抑制吸附直接殺傷0.052.13±1.124.55±1.090.0251.34±1.452.97±1.430.1019.21±2.6721.01±1.870.05014.27±1.0217.67±1.380.2031.38±3.3435.17±2.470.10034.09±1.5236.22±2.070.4048.87±2.5251.39±1.560.20045.32±2.7149.88±2.910.8067.45±3.7874.56±2.670.40072.32±3.5475.13±2.811.6075.41±1.0183.17±3.240.80084.22±1.0182.29±3.733.2084.44±2.7993.94±2.111.60093.01±2.4094.17±1.476.4094.08±1.4595.61±1.333.20097.00±1.2193.56±1.78

3討論

病毒對宿主細胞的致病作用是病毒致病機制中非常重要的一個方面。病毒增殖周期(吸附、穿入、脫殼、生物合成、裝配、成熟、釋放)的任何一個或多個環(huán)節(jié)都可能是藥物作用的靶點。本實驗證明甘草具有明顯的抑制RSV作用，既能干擾RSV的吸附、生物合成過程，也能直接對RSV產(chǎn)生殺傷作用。甘草比利巴韋林毒性低、使用安全范圍大，在一定濃度范圍內(nèi)，甘草濃度與對 RSV的抑制率呈量效關系，與利巴韋林抗RSV作用無明顯差異。

甘草影響RSV吸附過程可能通過其活性成分破壞RSV表面的蛋白結構，導致RSV吸附能力降低或甘草與RSV競爭結合Hep-2細胞表面的特異性受體，干擾RSV的吸附；甘草影響RSV的生物合成可能與其抑制病毒DNA聚合酶和(或)RNA反轉錄酶的活性有關，也可能是甘草刺激細胞分泌生物活性物質(zhì)，抑制病毒DNA的復制和轉錄過程；甘草也能直接殺滅病毒，可能是由于甘草含有能破壞RSV包膜等結構的有效成分或活性化合物。下一步將對甘草的有效成分進行分離提取，對各成分進行抗RSV的實驗研究，進一步探索甘草抗呼吸道合胞病毒的機制。

4參考文獻

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〔2014-09-18修回〕

(編輯郭菁/徐杰)