5-羥甲基糠醛對皮質(zhì)酮損傷型海馬神經(jīng)元P-synapsin Ⅰ蛋白表達的影響

張麗娜張?zhí)炝?金國琴戴薇薇林梅2

(上海中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生化教研室，上海201203)

摘要〔〕目的觀察熟地有效成分5-羥甲基糠醛對高濃度皮質(zhì)酮致海馬神經(jīng)元損傷及學習記憶相關(guān)蛋白P-synapsinI蛋白表達的影響。方法用24 h新生大鼠制備原代海馬神經(jīng)細胞。培養(yǎng)第8天用皮質(zhì)酮、RU38486、5-HMF處理細胞，將細胞分為正常組、模型組(1×10-4mol/L皮質(zhì)酮)、拮抗劑組(10-4mol/L皮質(zhì)酮+3 nmol/L RU38486)、5-羥甲基糠醛組(10-4mol/L 皮質(zhì)酮+ 0.5 mg/L 5-HMF)。24 h后，通過SYTO13-PI雙熒光染色法觀察各組細胞的形態(tài)及存活情況，MTT法測定細胞活性，生化方法檢測衰老特異性指標β-半乳糖苷酶活性， Western 印跡檢測學習記憶相關(guān)分子P-synapsinⅠ的蛋白表達。結(jié)果與正常組相比，模型組細胞死亡較多，細胞活力下降，β-半乳糖苷酶活性升高，P-synapsinⅠ蛋白表達顯著性降低；如上改變均被皮質(zhì)酮受體拮抗劑RU38486逆轉(zhuǎn)；一定濃度的5-羥甲基糠醛明顯減少死細胞數(shù)量，提高細胞活力，降低β-半乳糖苷酶活性，提高模型細胞P-synapsinⅠ蛋白表達。結(jié)論0.5 mg/L 5-羥甲基糠醛可以保護大鼠海馬神經(jīng)細胞免遭高濃度皮質(zhì)酮的損傷，通過調(diào)節(jié)學習記憶信號轉(zhuǎn)導途徑中的重要蛋白P-synapsinⅠ的蛋白表達，可能在延緩學習記憶功能退化中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞〔〕5-羥甲基糠醛；海馬神經(jīng)元；皮質(zhì)酮；P-synapsinⅠ；熟地

中圖分類號〔〕R966〔文獻標識碼〕A〔

基金項目：國家自然科學

Protein expression of P-synapsin Ⅰ following 5-HMF of SHUDI treatment in hippocampal neurons with corticosterone injury

ZHANG Li-Na,ZHANG Tian-Liang,JIN Guo-Qin,etal.ss

Department of Biochemistry,College of Basic Medicine,Shanghai University of TCM,Shanghai 201203,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effect of 5-HMF in SHUDI to P-synapsin Ⅰ protein expression in injured hippocampal neurons by high dose of corticosterone(CORT). MethodsHippocampal neurons were cultured from newborn (24 h) rats. On the eighth day the neurons were treated with CORT，RU38486 and 5-HMF. The cells were divided into control,model (containing 10-4mol/L CORT),RU38486 (containing 10-4 mol/L CORT+3 nmol/L RU38486) and 5-HMF (containing 10-4 mol/L CORT+0.5 mg/L 5-HMF) groups. 24 hours later，SYTO13-PI double-fluorescence staining,MTT assay,β-galactosidase assay and Western blot were carried out. ResultsCompared with the control group,both the cell survival rate and cell viability were decreased markedly (P<0.05),β-galactosidase activity was increased markedly(P<0.05) and P-synapsin Ⅰ protein expression was significantly decreased in model group. 5-HMF or RU38486 could invert above changes. Conclusions0.5 mg/L 5-HMF in SHUDI could significantly prevent the hippocampus neuron from injury. 5-HMF could change P-synapsin Ⅰ protein expression in injured hippocampal neurons by high dose of CORT to prevent and treat learning and memory impairment probably.

【Key words】5-HMF; Hippocampal neuron; Corticosterone(CORT); P-synapsin Ⅰ; SHUDI

1十堰市第十六中學2上海中醫(yī)藥大學教學實驗中心

第一作者：張麗娜(1980-)，女，在讀博士，講師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)(生化) 研究。

補腎滋陰藥能有效改善老年學習記憶減退〔1〕。如以熟地為主藥的左歸丸、六味地黃丸等補腎復方均可以改善學習記憶功能〔2，3〕。大量實驗也提示熟地本身也具有抗衰老及改善學習記憶的作用〔4，5〕。熟地即經(jīng)過炮制加工后的地黃，在加工過程中5-羥甲基糠醛(5-HMF)含量比炮制前增加20倍左右，是熟地質(zhì)量控制選擇的量化指標之一〔6〕。大腦邊緣系統(tǒng)——海馬區(qū)域是糖皮質(zhì)激素受體(GCR)密度最高的腦區(qū)，所以最容易受到高皮質(zhì)酮血癥的毒性影響，而海馬又與學習記憶密切相關(guān)，故認為海馬的皮質(zhì)酮毒性可能是老年學習記憶退化的重要起始原因之一。本研究旨在探討熟地改善老年學習記憶退化的分子機制及發(fā)揮作用的活性成分。

1材料與方法

1.1實驗動物及主要試劑清潔級出生24 h內(nèi)的SD大鼠，由上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。DMEM高糖培養(yǎng)液(Hyclone)、胎牛血清(杭州四季青公司)、0.25% Trypsin、Neurobasal培養(yǎng)基及B27(Gibco)、皮質(zhì)酮(US Biol)、RU38486、5-HMF(純度≥99%)及MTT(Sigma)、DMSO(Amresco)、SYTO13染料(Invitrogen)、PI(碘化丙錠)染料、免疫組化SP通用試劑盒(上海長島生物)，兔抗鼠NSE多克隆抗體、P-synapsinI兔抗大鼠多克隆抗體、羊抗小鼠(兔)IgG-HRP二抗(Santa Cruz)。

1.2主要儀器B5060EK CO2培養(yǎng)箱(Heraeus，德國)，Bio-hazard垂直式無菌無塵操作臺(造鑫企業(yè)有限公司，上海)，TH-3560滅菌鍋(造鑫企業(yè)有限公司，臺灣)，XDS-1B熒光倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，JA1003型電子分析天平(上海天平儀器廠)，F(xiàn)R-200凝膠掃描分析系統(tǒng)(上海復日科技有限公司)

1.3海馬神經(jīng)細胞原代培養(yǎng)取新生24 h的SD大鼠5只，75%酒精消毒，斷頸取頭，置于無菌培養(yǎng)皿中，迅速用眼科剪剪開頭部皮膚及顱骨，取出兩側(cè)大腦半球，用眼科剪小心分離出兩側(cè)海馬，置入少量無血清高糖DMEM培養(yǎng)液中，剪成約1～2 mm3的小塊后，加入0.25% Trypsin 0.02%EDTA 5 ml，把胰酶及組織塊一并吸入15 ml離心管中。細胞培養(yǎng)箱中孵育30 min，期間每10 min輕輕搖晃1次。取出，吸棄上清液，加入5 ml種植液(含20%BSA的高糖DMEM)靜置3 min以終止胰酶的消化。吸棄上清，再加入5 ml種植液，反復輕輕吹打25次，靜置3 min，吸取并保留上清細胞懸液于50 ml離心管中(置于冰上)。沉淀中再次加入5～6 ml種植液，步驟同上。反復3～4次，直至組織塊基本消失，合并每次細胞懸液至前一50 ml離心管中。細胞計數(shù)，種植液調(diào)整細胞濃度為0.5~1×107個/ml，接終于培養(yǎng)板中，96孔板120 μl，24孔板1 ml，6孔板3 ml。CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁后，全量改培養(yǎng)液為neurobasal+B27 (體積比為49∶1)，以后每2～3天半量換液，培養(yǎng)至第8天，進行NSE免疫細胞化學染色和分組用藥處理。

1.4海馬神經(jīng)細胞的鑒定NSE特異的免疫細胞化學染色法。細胞接種于6孔板，孔數(shù)n=6。用NSE多克隆抗體，依據(jù)免疫組織化學SP通用試劑盒方法鑒定神經(jīng)元。

1.55-HMF作用于模型細胞的量效觀察 在以往工作的基礎(chǔ)上〔7〕(采用濃度為10-4mol/L皮質(zhì)酮作用海馬神經(jīng)元制備皮質(zhì)酮損傷型海馬神經(jīng)細胞模型；用3 nmol/L皮質(zhì)酮受體拮抗劑RU38486作用該模型可成功拮抗皮質(zhì)酮對海馬神經(jīng)元的損傷；各用藥組用藥24 h，差異最顯著)，采用MTT法進行量效實驗，確定用藥組5-HMF(0.05，0.5，5，50 mg/L)最佳作用濃度。

1.6實驗分組將培養(yǎng)至第8天的生長良好的海馬神經(jīng)元分組用藥處理，共分為4組。用neurobasal+B27 (體積比為49∶1)培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，每2~3天換液`次。培養(yǎng)至第8天，棄去培養(yǎng)基，給貼壁細胞用藥。第1組用前述培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，即正常組；第2組用含終濃度為10-4mol/L皮質(zhì)酮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，即模型組；第3組用含終濃度為3 nmol/L皮質(zhì)酮受體拮抗劑RU38486和終濃度為10-4mol/L皮質(zhì)酮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，即拮抗劑組；第4組含終濃度為0.5 mg/L 5-HMF和終濃度為10-4mol/L皮質(zhì)酮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，即5-HMF組。

1.7SYTO13-PI雙熒光染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)及細胞存活率細胞接種于96孔板，每組細胞孔數(shù)n=6。每孔細胞加入2.5 μmol/L SYTO-13染液2 μl，用鋁箔遮蓋避光，室溫放置15 min；再向每孔培養(yǎng)細胞中加入2 μl PI染液，用鋁箔遮蓋避光，室溫放置15 min。小心吸棄上清液，用HEPES緩沖液輕輕洗滌2次，熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.8MTT法測定細胞的活力細胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，每組細胞孔數(shù)n=10。每孔細胞加入MTT試劑(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加入150 μl DMSO，振蕩10 min，酶標儀測定570 nm的吸光度(OD)值。

1.9β-半乳糖苷酶活性測定細胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，每組孔數(shù)n=10。按照β-半乳糖苷酶測定試劑盒進行測定。文獻報道，隨著細胞老化，在pH 6.0的條件下，細胞內(nèi)增高的β-半乳糖苷酶可降解其底物X-半乳糖，產(chǎn)生的藍色產(chǎn)物隨之增多。

1.10Western 印跡法測定學習記憶信號轉(zhuǎn)導通路相關(guān)分子P-synapsinⅠ蛋白表達細胞接種于6孔板，每組細胞孔數(shù)n=6。參照DBI公司的動物細胞總蛋白抽提試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒的方法抽提和定量細胞總蛋白。根據(jù)求出樣品的實際蛋白含量，求得在20 μl總上樣體積中的樣品體積，保證每個樣品上樣量為30 μg。加入上樣緩沖液，沸水浴中煮10 min。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗，4℃過夜，PBST洗膜，加入二抗，37℃條件孵育45 min，PBST洗膜。ECL顯色，圖像分析儀進行光密度積分掃描，做定量分析。

2結(jié)果

2.1神經(jīng)元鑒定結(jié)果經(jīng)過NSE特異的免疫細胞技術(shù)染色后，細胞的胞質(zhì)和突起均被染成棕黃色(如圖1)。清晰可見神經(jīng)元的胞體、樹突和軸突，表明海馬神經(jīng)細胞生長狀態(tài)及純度較好。

圖1　NSE染色實驗中培養(yǎng)第8天的海馬神經(jīng)元(×200)

2.25-HMF作用模型細胞的量效結(jié)果與正常組相比，10-4mol/L皮質(zhì)酮處理的模型組細胞的活力顯著下降(0.529±0.022 vs 0.722±0.015，P<0.05)。與模型組相比，5 mg/L 5-HMF與50 mg/L 5-HMF組的細胞活力顯著下降(0.354±0.017，0.296±0.013，P<0.05)，說明了此兩種濃度的5-HMF對海馬神經(jīng)元具有損傷作用，而與模型組相比，0.5 mg/L 5-HMF組的細胞活力顯著升高(0.637±0.010，P<0.05)，0.05 mg/L 5-HMF組與模型組無差異(0.524±0.022，P>0.05)。

結(jié)合形態(tài)學觀察，5 mg/L 5-HMF與50 mg/L 5-HMF組的絕大部分細胞消失，僅存的細胞也變小變圓，皺縮變形，細胞間連接完全消失；而0.5 mg/L 5-HMF組細胞形態(tài)與正常組相比并無顯著區(qū)別，胞核及核仁、細胞突起均清晰可見，樹突與軸突相連成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)；0.05 mg/L 5-HMF組細胞形態(tài)與模型組相比無顯著差異，細胞突起及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較正常組減少。

2.3SYTO13-PI雙重熒光染色法觀察各處理組海馬神經(jīng)細胞的存活情況PI染料可使死細胞染成紅色，SYTO13可使活細胞染成綠色。與正常組比較，模型組紅染細胞明顯增多，綠染細胞減少，與模型組比較，加入5-HMF與拮抗劑處理后，均可以明顯降低細胞死亡數(shù)量。拮抗劑RU38486對模型細胞存活率的改變證明了該損傷作用由皮質(zhì)酮受體介導。見圖2。

2.4MTT法檢測細胞的活性與正常組細胞比較，模型組細胞活力明顯下降(P<0.05)。皮質(zhì)酮受體拮抗劑RU38486組和5-HMF組細胞活力較模型組明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.5各組細胞β-半乳糖苷酶活性與正常組細胞相比較，模型組細胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活性明顯增高(P<0.05)。拮抗劑組、5-HMF組細胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活性明顯較模型組下降(P<0.05)。見表1。

2.6Western 印跡法檢測各組細胞P-synapsinⅠ蛋白表達與正常組相比，模型組細胞P-synapsinⅠ蛋白相對表達量顯著性降低(P<0.05)。拮抗劑組、5-HMF組P-synapsinⅠ蛋白相對表達量較模型組均顯著性升高(P<0.05)。見表1，圖3。

組別細胞活力570nmβ-半服糖苷酶活性505nmP-synapsinⅠ正常組0.748±0.0230.327±0.0900.927±0.065模型組0.538±0.0511)0.464±0.0441)0.082±0.0571)拮抗劑組0.658±0.0402)0.354±0.0332)0.605±0.0312)5-HMF組0.615±0.0362)0.353±0.0602)0.704±0.0492)

與正常組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

圖2　用藥24 h后的各用藥組海馬神經(jīng)元SYTO1313-PI雙重熒光染色(×200)

圖3　藥物處理24 h各組細胞P-synapsinⅠ蛋白表達

3討論

SynapsinⅠ是神經(jīng)元特異性突觸前囊泡膜磷酸蛋白，是突觸蛋白家族的第1個成員，被稱為突觸素Ⅰ或突觸蛋白1〔8〕。突觸蛋白磷酸化狀態(tài)及其mRNA水平的改變可能引發(fā)多種神經(jīng)疾病，因此突觸素常被運用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中。SynapsinⅠ具有多種蛋白激酶磷酸化的多個位點，尤其是PKA、Ca2+/CaMKⅡ和MAPK的主要底物。當SynapsinⅠ處于非磷酸化狀態(tài)時，可將儲存庫中的囊泡固定在細胞骨架上,使其準備隨時進入囊泡循環(huán)；當突觸前膜去極化，胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，激活PKA 、Ca2+/CaMKⅡ或通過BDNF-TrkB-MAPK通路磷酸化synapsinⅠ，囊泡即可從細胞骨架上釋放出來，進入突觸前膜的激活區(qū)，再進一步釋放神經(jīng)遞質(zhì)〔9〕。因此SynapsinⅠ的磷酸化水平可間接反映遞質(zhì)(如谷氨酸)的釋放和突觸的傳遞功能，參與學習記憶及LTP(突觸傳遞功能長時程增強)誘導〔10，11〕。

本研究說明GCR是皮質(zhì)酮損傷海馬神經(jīng)元活力和P-synapsinⅠ蛋白表達的重要中間環(huán)節(jié)。GCR屬于細胞內(nèi)受體，在海馬細胞等最為豐富。5-HFM可以保護大鼠海馬神經(jīng)細胞免遭高濃度皮質(zhì)酮的損傷，可能通過調(diào)節(jié)學習記憶信號轉(zhuǎn)導途徑中重要蛋白synapsinⅠ的磷酸化，在延緩學習記憶功能退化中發(fā)揮作用。

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〔2013-12-30修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)