王慧娟　馮社軍　李軍濤　武艷強

(邯鄲市中心醫(yī)院， 河北 邯鄲 056001)

曲格列酮上調(diào)PPARγ抑制炎癥狀態(tài)下小膠質(zhì)細胞iNOS表達的實驗研究*

王慧娟馮社軍李軍濤武艷強

(邯鄲市中心醫(yī)院， 河北 邯鄲 056001)

【摘要】目的探討曲格列酮能否通過上調(diào)PPARγ抑制炎癥狀態(tài)下小膠質(zhì)細胞iNOS表達，以及對細胞的保護作用。方法將BV2細胞分為4組，即對照組(Control組)、LPS組、LPS+曲格列酮組(LPS+Troglitazone組, LPS+Tro組)和LPS+曲格列酮+GW9662組(LPS+Troglitazone+GW9662組, LPS+Tro+GW組)，使用MTT法在0、24h對BV2細胞活性進行觀察，并在干預(yù)24小時后使用RT-PCR法和western blot法對BV2細胞iNOS和PPARγ mRNA和蛋白的表達水平進行檢測。結(jié)果在給予LPS干預(yù)24小時后BV2細胞活性明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；LPS+Tro組細胞活性較LPS組和LPS+Tro+GW組更高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；同時LPS組和LPS+Tro+GW組細胞活性差異未見統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在給予LPS干預(yù)24小時后BV2細胞iNOS mRNA和蛋白的表達水平較Control組細胞明顯增加，PPARγ mRNA和蛋白的表達水平較Control組細胞明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；同時LPS+Tro組細胞一氧化氮合成酶(iNOS)表達水平較LPS組和LPS+Tro+GW組降低，而PPARγ表達水平較LPS組和LPS+Tro+GW組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；同時LPS組和LPS+Tro+GW組細胞間iNOS和PPARγ表達水平差異未見統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。結(jié)論本實驗結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)下，曲格列酮可以通過促進PPARγ的表達下調(diào)BV2細胞iNOS的合成，并對BV2細胞具有保護作用。

【關(guān)鍵詞】曲格列酮； BV2細胞； iNOS； PPARγ； GW9662

腦卒中(stroke)相關(guān)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)元再次損傷和死亡的重要原因[1～3]。小膠質(zhì)細胞(microglia, MG)作為腦神經(jīng)組織中固有的免疫細胞，其在腦卒中相關(guān)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)過程中扮演著重要的角色[4,5]。研究證實，腦出血等狀態(tài)可直接導(dǎo)致小膠質(zhì)細胞的過度活化[5,6]。過度活化的小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶(induced nitric oxide synthase, iNOS)表達增加，隨即NO大量釋放導(dǎo)致過度的氧化應(yīng)激，損傷神經(jīng)元[7,8]。同時氧化應(yīng)激還可與炎癥反應(yīng)互為因果，使血管內(nèi)皮細胞通透性增加導(dǎo)致和加重腦水腫[4～7]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，氧化物酶體增殖激活受體γ (peroxisome proliferators-activated receptor gamma, PPARγ)與氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[8,9]。同時研究還證實，PPARγ是調(diào)節(jié)iNOS重要的核轉(zhuǎn)錄因子[10,11]。本實驗的目的是觀察PPARγ激動劑曲格列酮(troglitazone)是否能夠通過上調(diào)PPARγ抑制炎癥狀態(tài)下BV2細胞iNOS的表達及其對細胞的保護作用，擬為PPARγ激動劑進一步應(yīng)用于腦卒中的治療提供參考。

1材料和方法

1.1主要試劑PCR試劑盒購自寶生物工程有限公司；曲格列酮和GW9662購于美國Cayman Chemicals公司；兔抗鼠iNOS抗體、兔抗鼠PPARγ抗體和兔抗鼠β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；小牛血清(杭州四季青)；超純水。其余試劑均為分析純。

1.2細胞培養(yǎng)小膠質(zhì)BV2細胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清、100 g/L 青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48小時換液、傳代2次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。BV2細胞分為對照組(Control組)、LPS組、LPS+曲格列酮組(LPS+Troglitazone組, LPS+Tro組)和LPS+曲格列酮+GW9662組(LPS+Troglitazone+GW9662組, LPS+Tro+GW組)共4組。其中對照組細胞加入PBS；其余組使用終濃度為1 μg/ml 的LPS進行干預(yù)，在LPS干預(yù)30min后加入終濃度為10 μM的曲格列酮和/或10 μM 的GW9662 進行干預(yù)。

1.3細胞活性分析(MTT比色試驗)取對數(shù)生長期細胞消化制成單細胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔接種100μl約含5×103個細胞。貼壁后無血清培養(yǎng)細胞16～24 h，使細胞同步化。使用MTT比色試驗對0和24 h時的細胞生長狀態(tài)進行測定，重復(fù)實驗4次。細胞活性(%)=對應(yīng)時間點(OD干預(yù)組/OD對照組)×100%[12]。

1.4細胞iNOS和 PPARγ mRNA表達檢測干預(yù)24小時后，按照RT-PCR試劑盒說明書提取細胞總RNA。引物：iNOS正義：5′-GTGTTCCACCAGGA GATGTTG-3′，反義：5′-CTCCTGCCCACTGAGTT CGTC-3′；PPARγ正義：5′-GAGCCTGTGAGACCA ACAGC-3′，反義：5′-GATTCCGAAGTTGGTGGG CC-3′。β-actin正義：5′- CTCCATCCTGGCCTCGCT GT-3′，反義：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。按照試劑盒說明書介紹進行反轉(zhuǎn)錄和擴增實驗。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)攝影，Quantity One軟件對目的條帶進行掃描分析。用與β-actin PCR產(chǎn)物條帶灰度比值作為iNOS mRNA的相對表達量。

1.5Western blot法檢測細胞中蛋白表達在干預(yù)24小時后，按照試劑盒操作要求首先提取細胞總蛋白，并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1小時，分別加入兔抗鼠iNOS抗體 (1∶900)、兔抗鼠PPARγ抗體(1∶700)和兔抗鼠β-actin抗體(1∶1500)，4 °C孵育過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2 000)，用ECL進行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進行掃描。

2結(jié)果

2.1MTT法檢測結(jié)果在給予LPS (1 μg/ml)干預(yù)24小時后BV2細胞活性明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；同時LPS+Tro組細胞活性較LPS組和LPS+Tro+GW組更高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；但LPS組和LPS+Tro+GW組間細胞活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1　MTT比色法測定BV2細胞活性

注：與Control組比較，①P<0.05；與LPS組比較，②P<0.05

2.2iNOS mRNA和蛋白表達在給予LPS干預(yù)24小時后BV2細胞iNOS mRNA和蛋白的表達水平較Control組細胞明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；同時LPS+Tro組細胞iNOS mRNA和蛋白的表達水平較LPS組和LPS+Tro+GW組降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；但LPS組和LPS+Tro+GW組細胞間iNOS mRNA和蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見圖1、表2。

2.3PPARγ mRNA和蛋白表達使用RT-PCR和western blot對BV2細胞PPARγ mRNA和蛋白表達進行分析，在給予LPS干預(yù)24小時后BV2細胞PPARγ mRNA和蛋白的表達水平較Control組細胞明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；同時LPS+Tro組細胞PPARγ mRNA和蛋白的表達水平較LPS組和LPS+Tro+GW組升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；但LPS組和LPS+Tro+GW組細胞間PPARγ mRNA和蛋白的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見圖2、表2。

圖1BV2細胞iNOS表達的RT-PCR和western blot結(jié)果

Figure 1The RT-PCR and western blot results of iNOS in BV2 microglia

圖2 BV2細胞PPARγ表達的RT-PCR和western blot結(jié)果

Figure 2The RT-PCR and western blot results of PPARγ in BV2 microglia

表2　BV2細胞iNOS、PPARγ mRNA和蛋白的表達水平

注：與Control組比較，①P<0.05；與 LPS組比較，②P<0.05

3討論

腦卒中(stroke)是指由于腦血管動脈粥樣硬化狹窄、血栓栓塞以及腦血管破裂等因素造成的急性腦血液循環(huán)障礙，臨床上主要表現(xiàn)為一次性或永久性腦功能障礙[1～5,13]。腦卒中一般分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中。由于隨著社會老齡化加劇，動脈粥樣硬化、原發(fā)性高血壓、糖尿病和心房顫動等慢性疾病的患病率增加，腦卒中發(fā)病率亦呈逐年上升趨勢。目前認為急性腦梗死治療的主要目的之一是改善缺血半暗帶潛在可挽救的缺血腦細胞，防止繼發(fā)性損害的發(fā)生[13]。由于氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)互為因果，同時二者在腦卒中的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的角色，急性腦梗死導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)可誘導(dǎo)大量的氧自由基產(chǎn)生和炎癥介質(zhì)的釋放，并可造成腦血管內(nèi)皮細胞功能的異常，進一步增加腦血管通透性而加重腦組織水腫；同時氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)又會進一步加重腦卒中本身導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡等病理生理過程的出現(xiàn)，形成惡性循環(huán)。故有效抑制腦卒中相關(guān)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對保護神經(jīng)細胞具有重要意義[14，15]。研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞(microglia, MG)作為腦神經(jīng)組織中固有的免疫細胞具有吞噬細胞的特征，其在腦卒中相關(guān)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)過程中扮演著重要的角色。小膠質(zhì)細胞分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是神經(jīng)膠質(zhì)細胞中的一員，數(shù)量約占神經(jīng)膠質(zhì)細胞總數(shù)的5%～10%，其體積最小，在腦組織中廣泛分布，以海馬、嗅葉和基底神經(jīng)節(jié)處分布最為豐富，丘腦和下丘腦次之，腦干和小腦數(shù)量最少[16]。一般狀況下，小膠質(zhì)細胞處于靜息和休眠狀態(tài)。當(dāng)腦卒中發(fā)生時小膠質(zhì)細胞迅速活化，從靜止的分支樣轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨陌⒚装蜆拥男螒B(tài)，大量的表面分子迅速上調(diào)，包括CD14、MHC、趨化因子受體和其他一些活化標(biāo)記分子。目前認為，小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的免疫活性細胞和最重要的抗原提呈細胞[4,5]。

過氧化物酶體增殖激活受體(peroxisome proliferators-activated receptor, PPAR)包括PPARα (NR1C1)、PPARβ/δ (NR1C2)和PPARγ (NR1C3) 3個亞型[7～11]。目前研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，一方面PPARγ可直接通過核轉(zhuǎn)位與相應(yīng)的靶基因調(diào)控位點結(jié)合調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性；同時也可通過蛋白-蛋白相互作用和競爭輔助因子調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)、轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)和活化蛋白-1(AP-1)的活化，參與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的調(diào)控[7～10]。劉卓等研究發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下PPARγ激動劑吡格列酮可以抑制星形膠質(zhì)細胞iNOS的表達[17]。同時肖敏等研究也證實，上調(diào)PPARγ的表達可以有效抑制慢性哮喘相關(guān)的氣道炎癥反應(yīng)[18]。首先我們對BV2細胞活性進行分析發(fā)現(xiàn)，在LPS干預(yù)24小時后細胞活性明顯降低，但PPARγ激動劑曲格列酮可以改善LPS降低的BV2細胞活性，而PPARγ抑制劑GW9662能夠抵消曲格列酮的改善作用。本結(jié)果表明，PPARγ激動劑曲格列酮可以抑制LPS誘導(dǎo)的BV2細胞損傷和死亡，對BV2細胞有保護作用。

誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶(induced nitric oxide synthase, iNOS)在腦卒中導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色[19,20]。研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中可導(dǎo)致腦組織中iNOS的表達明顯增加，其合成的NO是氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要參與者，可直接導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和炎癥細胞的激活，抑制iNOS的合成可減輕細胞膜的損傷，對神經(jīng)元有保護作用。同時研究證實，PPARγ是iNOS重要的調(diào)節(jié)因素[19,20]。我們的實驗也發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動劑曲格列酮可抑制LPS所上調(diào)的iNOS mRNA和蛋白的表達水平，但該作用能夠被PPARγ抑制劑GW9662所抵消。同時我們也對PPARγ mRNA和蛋白的表達水平進行了分析，發(fā)現(xiàn)曲格列酮可以有效地上調(diào)LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下BV2細胞PPARγ的表達，而GW9662可拮抗曲格列酮對PPARγ的調(diào)節(jié)作用。本結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)狀態(tài)下PPARγ激動劑曲格列酮可以通過上調(diào)PPARγ抑制BV2細胞iNOS的合成。

4結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，在LPS誘導(dǎo)的炎癥狀態(tài)下，曲格列酮可以通過促進PPARγ的表達下調(diào)BV2細胞iNOS的合成，并對BV2細胞具有保護作用。本實驗為PPARγ激動劑應(yīng)用于改善腦卒中相關(guān)的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，以及神經(jīng)保護治療奠定了理論基礎(chǔ)，但仍需進一步的實驗研究證實其在臨床中的價值和作用。

【參考文獻】

[1]馮社軍, 趙現(xiàn), 劉運平, 等. 急性腦血管疾病并發(fā)感染的臨床分析[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2013, 25(8): 1208-1209.

[2]宋晴. 缺血性腦卒中發(fā)病概率模型評價及干預(yù)措施研究[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2012, 24(2): 338-339.

[3]馮社軍, 趙現(xiàn), 劉運平, 等. 腦卒中復(fù)發(fā)影響因素的 Cox 回歸分析[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2013, 25(6): 857-859.

[4]韓麗娟. 小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)缺血性卒中后炎癥的機制研究進展[J]. 國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志(ISTIC), 2012, 39(4):461-462.

[5]王新, 李明軍, 張坤, 等. 腦出血與小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥相關(guān)性[J]. 中國老年學(xué)雜志, 2013, 33(13): 3268-3270.

[6]Gelosa P, Lecca D, Fumagalli M,etal. Microglia is a key player in the reduction of stroke damage promoted by the new antithrombotic agent ticagrelor [J]. J Cereb Blood Flow Metab, 2014,45(10):1038.

[7]Xu MX, Tan BC, Zhou W,etal. Resolvin D1, an endogenous lipid mediator for inactivation of inflammation-related signaling pathways in microglial cells, prevents lipopolysaccharide-induced inflammatory responses [J]. CNS Neurosci Ther, 2013, 19(4): 235-243.

[8]尹鵬, 胡君, 儲著凌, 等. 替米沙坦通過上調(diào) PPAR-γ 促進結(jié)腸癌 SW480 細胞 TIMP-1 表達的實驗研究[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2014, 26(2): 160-162.

[9]何斌, 何慶. PPARγ 及配體在肺損傷中的作用[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2007, 5: 111.

[10] Betz B, Schneider R, Kress T,etal. Rosiglitazone affects nitric oxide synthases and improves renal outcome in a rat model of severe ischemia/reperfusion injury [J]. Ppar Res, 2012, 20(12): 219319.

[11] Adabi Mohazab R, Javadi-Paydar M, Delfan B,etal. Possible involvement of PPAR-gamma receptor and nitric oxide pathway in the anticonvulsant effect of acute pioglitazone on pentylenetetrazole-induced seizures in mice [J]. Epilepsy Res, 2012, 101(1-2): 28-35.

[12] Wei D, Peng JJ, Gao H,etal. Digoxin Downregulates NDRG1 and VEGF through the Inhibition of HIF-1α under Hypoxic Conditions in Human Lung Adenocarcinoma A549 Cells [J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(4): 7273-7285.

[13] 徐巧絨, 徐家萍, 李歡, 等. 青年缺血性腦卒中危險因素及病因分析[J]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 23(10): 95-97.

[14] Zhou Y, Wang Y, Wang J,etal. Inflammation in intracerebral hemorrhage: from mechanisms to clinical translation [J]. Prog Neurobiol, 2014, 115: 25-44.

[15] Lin S, Yin Q, Zhong Q,etal. Heme activates TLR4-mediated inflammatory injury via MyD88/TRIF signaling pathway in intracerebral hemorrhage [J]. J Neuroinflammation, 2012, 9:46.

[16] 賈濟, 劉愛秀, 朱蕭玲, 等. AM1241預(yù)處理對脂多糖所致小膠質(zhì)細胞活化及損傷的影響[J]. 中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 10(6): 587-590.

[17] 劉卓, 金英, 隋海娟, 等. 吡格列酮對脂多糖誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達的抑制作用[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2012, 26(003): 305-309.

[18] 肖敏, 朱濤, 汪濤, 等. 甘草酸二銨抑制慢性哮喘模型小鼠氣道平滑肌增生[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2013, 33(10): 1416-1420.

[19] 僧志遠, 鞏守平, 呂健, 等. Bosentan 對大鼠脊髓缺血再灌注損傷后一氧化氮及一氧化氮合酶表達的影響[J]. 西部醫(yī)學(xué), 2012, 24(6): 1039-1044.

[20] Heeba GH, El-Hanafy AA. Nebivolol regulates eNOS and iNOS expressions and alleviates oxidative stress in cerebral ischemia/reperfusion injury in rats [J]. Life Sci, 2012, 90(11-12): 3 88-395.

Troglitazone reduces the expression of iNOS via up-regulation of PPARγ in BV2 microgliaWANG Huijuan，F(xiàn)ENG Shejun，LI Juntao，etal

(HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate whether PPARγ agonist troglitazone would inhibit iNOS expression via up-regulation of PPARγ in BV2 microglia in LPS induced inflammation. MethodsMTT was used to measure the cell viabilities at 0h and 24h. RT-PCR and western blot were included to measure the mRNA and protein expression of iNOS and PPARγ, respectively. ResultsAfter 24 hours LPS stimulation, the cell viabilities of BV2 microglia was largely reduced. However, troglitazone improved the LPS-reduced cell viability, and this effect of troglitazone was noticeably blocked by GW9662. Meanwhile, the LPS-induced over-expression of iNOS were significantly reduced, and, the LPS-induced down-regulation of PPARγ were remarkably increased by troglitazone intervention in BV2 microglia. Additionally, these effects of troglitazone were markedly abrogated by PPARγ antagonist GW9662. ConclusionPPARγ agonist troglitazone could inhibit the expression of iNOS through the up-regulation of PPARγ in BV2 microglia in LPS induced inflammation.

【Key words】Troglitazone; BV2 microglia; iNOS; PPARγ; GW9662

(收稿日期：2014-12-10； 編輯： 母存培)

通訊作者：李軍濤， E-mail：lijuntao2014@163.com

基金項目：河北省衛(wèi)生廳重點科技研究計劃(20130359)

【中圖分類號】R-33

【文獻標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.09.004