沙格列汀抑制NF-κB信號(hào)通路下調(diào)LPS誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞MCP-1的表達(dá)*

李清福1夏纓2李曉艷1何彥蓉1張維3李露4

(成都軍區(qū)機(jī)關(guān)醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科; 2.第二門(mén)診部, 四川 成都 610000;3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院， 四川 成都 610500;

4.四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都 610041)

【摘要】目的探討二肽基肽酶4(DPP-4)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑沙格列汀(saxagliptin)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)狀態(tài)下人腎小管上皮HK-2細(xì)胞MCP-1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用及相關(guān)的分子機(jī)制。方法將人腎小管上皮細(xì)胞HK-2細(xì)胞分為3組，分別為對(duì)照組(Control組)、LPS+沙格列汀 (LPS+SAX組)和LPS組。在干預(yù)12小時(shí)后使用RT-PCR法和western blot法對(duì)HK-2細(xì)胞MCP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)；并使用western blot法對(duì)HK-2細(xì)胞NF-κB p65活化水平(phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值)進(jìn)行分析。結(jié)果與Control組相比較，在LPS干預(yù)12小時(shí)后 HK-2細(xì)胞MCP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平以及phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但LPS組較LPS+SAX組MCP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)的升高以及phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值的增加更加顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論DPP-4抑制劑沙格列汀可以通過(guò)抑制NF-κB的磷酸化下調(diào)LPS誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞MCP-1合成和釋放并對(duì)其產(chǎn)生保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】沙格列??； HK-2細(xì)胞； 單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)； 核轉(zhuǎn)錄因子-κB (NF-κB)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R 446

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.10.005

Abstract【】ObjectiveTo explore whether saxagliptin could down-regulate LPS-induced MCP-1 expression in human proximal tubular epithelial cells, and its potential molecular mechanism. MethodsHuman proximal tubular epithelial cells (HK-2 cells) were divided into 3 groups, Control group, LPS+saxagliptin group (LPS+SAX group) and LPS group. RT-PCR was used to measure the mRNA expression of MCP-1. The protein expression of MCP-1 and the phosphorylation level of NF-κB p65 were analyzed by western blot. ResultsAfter 12 hours LPS stimulation, the mRNA and protein expression of MCP-1 were remarkably up-regulated, and the ratio of phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65 were sharply raised. Then, LPS-induced the up-regulation of MCP-1 and the raised ratio of phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65 were all noticeably inhibited by saxagliptin in HK-2 cells. ConclusionSaxagliptin down-regulates LPS-induced MCP-1 expression possibly via inhibition of NF-κB in human proximal tubular epithelial cells (HK-2 cells).

基金項(xiàng)目：四川省教育廳科研課題(11ZB172)。

通訊作者：李清福，E-mail:liqingfucdjq2010@163.com

收稿日期：( 2014-10-10； 編輯： 陳舟貴)

Saxagliptin down-regulates LPS-induced MCP-1 expression via inactivation of NF-κB in human proximal tubular epithelial cellsHE Rong1, LI Qingfu1, XIA Ying2,etal

(1.DepartmentofEndocrinology,TheAffiliatedHospitalofChengduMilitaryRegion,Chengdu610000,China;

2.DepartmentofTheSecondOutpatient,TheAffiliatedHospitalofChengduMilitaryRegion,Chengdu610500,China;

3.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610000,China;

4.WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610041,China)

【Key words】Saxagliptin; HK-2 cells; Monocyte chemotactic protein-1; NF-κB

胰高糖素樣肽-1 (glucagon-like peptide-1, GLP-1)屬于腸肽類(lèi)激素(incretin)，主要由腸道內(nèi)L細(xì)胞合成和分泌，具有包括調(diào)節(jié)胰島素分泌、糖代謝和脂代謝等多種生理效應(yīng)[1～4]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)GLP-1還具有調(diào)節(jié)能量代謝以外的包括抑制炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激、抗器官纖維化以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)[2～9]。同時(shí)發(fā)現(xiàn)二肽基肽酶4 (dipeptidyl peptidase, DPP-4)是GLP-1代謝最主要的關(guān)鍵酶，抑制DPP-4可以有效的減少和延遲GLP-1的分解和代謝[2～9]。DPP-4競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑和GLP-1擬似物已廣泛應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病的臨床治療[10]。本研究主要觀察DPP-4競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑沙格列汀(saxagliptin)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)損傷狀態(tài)下的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞的保護(hù)作用及相關(guān)的分子機(jī)制。

1材料和方法

1.1主要試劑和材料人腎小管上皮HK-2細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；PCR試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司；沙格列汀購(gòu)買(mǎi)于上海施貴寶公司；鼠抗人β-actin抗體、鼠抗人MCP-1抗體、鼠抗人NF-κB p65抗體和鼠抗人phospho-NF-κB p65抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)，小牛血清(杭州四季清)，超純水。其余試劑均為分析純。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人腎小管上皮HK-2細(xì)胞常規(guī)接種在含10%胎牛血清和青霉素、100 g/L 鏈霉素的DEME培養(yǎng)液中，置于37℃、95%空氣、5 % CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每48 h換液、傳代2次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。HK-2細(xì)胞分為對(duì)照組(Control組)、LPS+沙格列汀 (LPS+SAX組)和LPS組。其中對(duì)照組細(xì)胞加入PBS；LPS組和LPS+沙格列汀組加入LPS (1 μg/ml)；LPS+沙格列汀加入終濃度為0.5 μM的沙格列汀溶液進(jìn)行干預(yù)。

1.2.2細(xì)胞MCP-1 mRNA表達(dá)檢測(cè)干預(yù)12h后，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA。引物：MCP-1正義5′-GCTCGCTCAGCCAGATGCAA T-3′，反義5′-TGGGTTGTGGAGTGAGTGTTC-3′和β-actin正義：5′-CGAGCGGGCTACAGCTTC-3′，反義：5′-GTCACGCACGATTCCCTCT-3′。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)介紹進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)。應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)攝影，Quantity One軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描分析。用與β-actin PCR產(chǎn)物條帶灰度比值作為MCP-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中MCP-1蛋白表達(dá)和NF-κB p65活化水平干預(yù)12h后，按操作要求，首先提取細(xì)胞總蛋白，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜上，用脫脂奶粉封閉1 h，分別加入鼠抗人單克隆抗體MCP-1 (1∶800)、phospho-NF-κB p65 (1∶1000)、 NF-κB p65 (1∶1000)和β-actin (1∶2000)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000)，用ECL進(jìn)行顯色，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩樣本均數(shù)多重比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MCP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)在干預(yù)12h后，對(duì)人腎小管上皮HK-2細(xì)胞MCP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平使用RT-PCR法和western blot法進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)與Control組相比較，HK-2細(xì)胞在LPS干預(yù)后MCP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LPS組細(xì)胞MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較LPS+SAX組細(xì)胞增加更加顯著，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1和表1。

圖1HK-2細(xì)胞MCP-1表達(dá)的RT-PCR和western blot結(jié)果

Figure 1The RT-PCR and Western blot results of MCP-1 in HK-2 cells

Table 1The mRNA and protein expression of MCP-1, and the activation of NF-κB p65 in HK-2 cells(±s)

組別MCP-1mRNAMCP-1蛋白phospho-NF-κBp65/totalNF-κBp65Control組0.17±0.30.15±0.040.19±0.05LPS+SAX組0.63±0.15①②0.54±0.09①②0.58±0.13①②LPS組0.92±0.04①0.96±0.08①0.95±0.12①

注：與Control組相比較①P<0.05；與LPS組相比較②P<0.05。

2.2NF-κB p65活化水平在干預(yù)12h后，對(duì)人腎小管上皮HK-2細(xì)胞NF-κB p65活化水平即NF-κB p65磷酸化水平(phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65比值)使用western blot進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)與Control組比較，HK-2細(xì)胞在LPS干預(yù)后NF-κB p65磷酸化水平顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)LPS組細(xì)胞NF-κB p65磷酸化水平較LPS+SAX組細(xì)胞上調(diào)更加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2和表1。

圖2HK-2細(xì)胞NF-κB p65活化的western blot結(jié)果

Figure 2The Western blot results of the activation of NF-κB p65 in HK-2

3討論

研究發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞損傷及損傷后相關(guān)的腎間質(zhì)纖維化在急性腎損傷(acute kidney injury, AKI)、糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)及多種原發(fā)性腎小球腎炎中扮演著重要的角色，保護(hù)和減輕腎小管上皮細(xì)胞損傷是治療急性腎損傷和糖尿病腎病等腎臟疾病的關(guān)鍵和重點(diǎn)[11～16]。

胰高糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)屬于腸肽類(lèi)激素(incretin)，主要由廣泛分布于小腸和大腸的L細(xì)胞合成和分泌[1～9]。研究發(fā)現(xiàn)GLP-1的分泌主要呈血糖濃度依賴(lài)性控制，即當(dāng)血糖水平上升時(shí)GLP-1釋放增多，血糖水平下降時(shí)釋放減少。二肽基肽酶4 (dipeptidyl peptidase, DPP-4)是GLP-1代謝的關(guān)鍵酶，抑制DPP-4可以有效的減少和延遲GLP-1的分解和代謝[1～9]。沙格列汀(saxagliptin)作為DPP-4抑制劑已廣泛應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病的臨床治療[10]。GLP-1主要通過(guò)與GLP-1受體(GLP-1R)結(jié)合產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胰腺β細(xì)胞表面存在大量GLP-1R，當(dāng)GLP-1與GLP-1R結(jié)合后可通過(guò)PKA等信號(hào)通路誘導(dǎo)胰島素的合成和分泌增加，維持體內(nèi)血糖水平的相對(duì)恒定[1～9]。同時(shí)近期的研究發(fā)現(xiàn)，GLP-1R還廣泛表達(dá)于胰腺組織以外的多種組織細(xì)胞[17～19]。Fujita H等使用基因敲除小鼠證實(shí)小鼠腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞表面存在GLP-1R的表達(dá)[17]。Thomson SC等人的研究發(fā)現(xiàn)大鼠近曲小管細(xì)胞存在GLP-1R的表達(dá)[18]。Romaní-Pérez M等證實(shí)肺組織中II肺泡上皮細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞表明存在GLP-1R的表達(dá)[19]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)GLP-1還具有獨(dú)立于降糖等調(diào)節(jié)能量代謝以外的包括抑制炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激、抗器官纖維化、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬等多種藥理和生物學(xué)效應(yīng)[9, 20]。Viby NE等的研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可以有效抑制COPD小鼠的肺部炎癥水平并改善其肺功能和死亡率。Gou S等人的研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可以有效的抑制博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺間質(zhì)纖維化[9]。Yi B等的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GLP-1R激動(dòng)劑exendin-4可以通過(guò)抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, RAGE)的表達(dá)減輕高脂血癥有誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[21]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)屬于CC類(lèi)趨化因子家族成員，多種細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、肺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞可在炎癥、氧化應(yīng)激和損傷狀態(tài)下大量表達(dá)[22, 23]。MCP-1可以通過(guò)與對(duì)應(yīng)的趨化因子受體，包括CCR2、CCR4和CCR10結(jié)合，進(jìn)一步誘導(dǎo)單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的激活和聚集，同時(shí)進(jìn)一步刺激相應(yīng)細(xì)胞合成和釋放炎癥介質(zhì)和粘附分子，對(duì)炎癥反應(yīng)產(chǎn)生放大作用[22, 23]。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)MCP-1的表達(dá)水平與糖尿病腎病和急性腎損傷等狀態(tài)下腎組織炎癥程度密切相關(guān)[22, 23]。目前部分研究認(rèn)為血和/或尿液中MCP-1水平可用于DN和AKI嚴(yán)重程度的判定以及治療效果的檢測(cè)[22, 23]。同時(shí)張繼強(qiáng)等人的研究證實(shí)下調(diào)MCP-1的表達(dá)可以有效抑制和延緩DN大鼠腎臟的炎癥反應(yīng)和病理改變[22]。Hu F等人的研究認(rèn)為在DN和AKI的炎癥狀態(tài)下MCP-1是導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維的重要因素，下調(diào)MCP-1的表達(dá)可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞損傷和小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生[23]。本實(shí)驗(yàn)中我們使用LPS誘導(dǎo)人腎小管上皮HK-2細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和損傷。并發(fā)現(xiàn)在給予LPS干預(yù)12小時(shí)后HK-2細(xì)胞MCP-1 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)給予沙格列汀干預(yù)的HK-2細(xì)胞較未干預(yù)細(xì)胞MCP-1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平更低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。該結(jié)果表明沙格列汀可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞MCP-1的合成和表達(dá)。

近期研究表明GLP-1對(duì)炎癥的調(diào)控作用與調(diào)節(jié)NF-κB的活化密切相關(guān)[9]。Gou S等人的研究發(fā)現(xiàn)GLP-1可以通過(guò)抑制NF-κB p65的磷酸化抑制博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[9]。同時(shí)大量研究證實(shí)NF-κB信號(hào)通路對(duì)于MCP-1的表達(dá)具有關(guān)鍵調(diào)控作用[24]。本實(shí)驗(yàn)中我們使用western blot法對(duì)NF-κB p65的磷酸化進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)在給予LPS干預(yù)12小時(shí)后HK-2細(xì)胞NF-κB p65活化水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且LPS組細(xì)胞NF-κB p65磷酸化水平較LPS+SAX組細(xì)胞上調(diào)更加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。該結(jié)果表明在人腎小管上皮HK-2細(xì)胞中沙格列汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的NF-κB p65磷酸化有顯著的抑制作用。

4結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DPP-4抑制劑沙格列汀可通過(guò)抑制NF-κB磷酸化抑制LPS誘導(dǎo)的人腎小管上皮HK-2細(xì)胞MCP-1合成和釋放并對(duì)其產(chǎn)生保護(hù)作用。

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本刊對(duì)來(lái)稿中法定計(jì)量單位的書(shū)寫(xiě)要求

根據(jù)國(guó)家頒布的有關(guān)法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)，作者來(lái)稿中務(wù)必注意單位名稱(chēng)與單位符號(hào)不可混用，如ng·kg-1·天-1應(yīng)改為ng/kg·d；組合單位符號(hào)中表示相除的斜線(xiàn)多于1條時(shí)，如ng/kg/min應(yīng)采用ng/kg·min的形式。在首次出現(xiàn)不常用的法定計(jì)量單位處用括號(hào)加注與舊制單位的換算系數(shù)，下文再出現(xiàn)時(shí)只列法定計(jì)量單位。人體及動(dòng)物體內(nèi)的壓力單位使用mm Hg或cm H2O，但文中首次出現(xiàn)時(shí)用括號(hào)加注(1 mm Hg=0.133 KPa)。正文中時(shí)間的表達(dá)，凡前面帶有具體數(shù)據(jù)者應(yīng)采用d、h、min、s，而不用天、小時(shí)、分鐘、秒。量的符號(hào)一律用斜體字母，如吸光度(舊稱(chēng)光密度)的符號(hào)為A，“A”為斜體字。

(本刊編輯部)