非諾貝特及二甲雙胍對(duì)非酒精性脂肪性肝病大鼠的干預(yù)作用及機(jī)制*

黎瑤唐明薇邱平蘭天梅希

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科， 四川 成都 610500)

【摘要】目的比較過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)和腺苷一磷酸激活蛋白激酶α(AMPKα)的配體非諾貝特和二甲雙胍對(duì)非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠的干預(yù)作用并探討其可能機(jī)制。方法Wistar大鼠分別予正常飼料喂養(yǎng)(對(duì)照組，Control)和高脂飲食喂養(yǎng)16周后又分為高脂飲食組(HF)、高脂飲食加非諾貝特組(FF)及高脂飲食加二甲雙胍組(Met)每組12只，并繼續(xù)喂養(yǎng)4周后檢測(cè)：①測(cè)血清甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、空腹血糖、胰島素含量。②取肝組織測(cè)TG含量。③肝組織HE染色觀察病理形態(tài)。④RT-PCR及Western-blot分別檢測(cè)肝臟AMPKα1和2、PPARα、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT-1)的mRNA及蛋白含量。⑤測(cè)肝組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。結(jié)果①高脂飲食可升高血脂質(zhì)譜、ALT和空腹血糖(P<0.05)，非諾貝特及二甲雙胍均能改善血脂(P<0.05)，但非諾貝特不能糾正ALT、空腹血糖(P>0.05)，而二甲雙胍可改善上述指標(biāo)(P<0.05)。②高脂飲食可使肝臟TG含量增加(P<0.05)，非諾貝特不能糾正高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟TG增加(P>0.05)，而二甲雙胍則使其降低(P<0.05)。③高脂飲食組肝臟病理學(xué)形態(tài)提示NAFLD改變；給予非諾貝特病理學(xué)較單純高脂飲食組形態(tài)無(wú)改善，而二甲雙胍病理學(xué)形態(tài)有所改善。④高脂飲食組AMPKα1、CPT-1的蛋白及mRNA表達(dá)下降、PPARα和ACC蛋白及mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；非諾貝特顯著升高PPARα及CPT-1蛋白及mRNA表達(dá)(P<0.05)，而二甲雙胍以升高AMPK及恢復(fù)ACC的蛋白及mRNA表達(dá)為主(P<0.05)。⑤高脂飲食組肝組織MDA含量增加、SOD含量下降(P<0.05)，非諾貝特使得下降的MDA回升(P<0.05)，二甲雙胍降低則進(jìn)一步降低MDA、升高SOD(P<0.05)。結(jié)論非諾貝特雖能降低血脂，但不能改善NAFLD，而二甲雙胍可改善NAFLD，可能與非諾貝特過(guò)度激活PPARα導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，而二甲雙胍則以激活A(yù)MPK為主，導(dǎo)致胰島素抵抗改善、脂肪合成下降、分解適度增加有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】非諾貝特; 二甲雙胍; 過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α; AMP激活的蛋白激酶; 非酒精性脂肪性肝病

【中圖分類號(hào)】R 575.2`+9

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.10.003

Abstract【】ObjectiveTo compare the different effects on NAFLD of Metformin and fenofibrate, the ligand of PPARaαand AMPKαrespectively. MethodsWistar rats received normal diet (control group) and high fat diet. After 16 weeks, the latter group was divided into high diet group (HF), high fat diet pulse fenofibrate group (FF), and high fat diet pulse metformin group (Met). All rats were feed for the next 4 weeks. TG, CHO, LDL-C, ALT, fast glucose and insulin were measured. TG in hepatic tissue was detected. The pathological change of hepatic tissue was observed with HE staining. The mRNA and protein contents of AMPKα1, 2, PPARα, ACC and CPT-1 were detected with RT-PCR and Western-blot. ⑤ The contents of MDA and SOD in hepatic tissue were detected. Results High fat diet would elevate blood lipid, ALT, and fasting glucose(P<0.05), while fenofibrate and metformin could correct the change of blood lipid induced by high fat diet(P<0.05). Metfirmin could improve blood glucose and ALT, but fenofibrate could not(P>0.05). High fat diet elevated liver TG. Fenofibrate could not correct the increased liver TG(P>0.05), but metformin could(P<0.05). High fat diet induced the liver steatosis. Metformin improved liver pathology morphology, while fenofibrate could not. The mRNA and protein expression of AMPKα1 and CPT-1 were decreased in High fat diet group (P<0.05),

基金項(xiàng)目：四川省衛(wèi)生廳科研課題(120478)

收稿日期：( 2015-04-09； 編輯： 陳舟貴)

The effects and mechanism of Fenofibrate and Metformin on nonalcoholic fatty liver disease in ratsLI Yao, TANG Mingwei, QIU Ping,etal

(DepartmentofEndocrinology,ChengduMedicalCollegeHospital,Chengdu610500,China)

while that of PPARαand ACC were increased(P<0.05). Fenofibrate raised mRNA and protein of PPARα and CPT-1(P<0.05), while metformin mainly rised AMPK and restored the ACC protein and mRNA expression(P<0.05). High fat diet could elevate MDA content in liver and decline SOD(P<0.05). Fenofibrate raised MDA further, while metformin reduced MDA and raised SOD(P<0.05). ConclusionsFenofibrtae could reduced blood lipid, but cannot improved NAFLD, while metformin could improve NAFLD, which may be concerned with the oxidative damage induced by excessive activation of PPARα by fenofibrate. Metformin was mainly activating AMPK, resulting in an improvement of insulin resistance, and a decline of fat synthesis, and a modest increase of fat decomposition.

【Key words】Fenofibrate; Metformin; PPARaα; AMPKα; NAAFLD

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外飲酒、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎以及遺傳性肝病等病因，以彌漫性肝細(xì)胞脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征[1]。甘油三酯(TG)在肝臟中沉積是NAFLD的使動(dòng)因素，如何促進(jìn)肝細(xì)胞中TG的分解、抑制其合成是治療NAFLD的重要研究方向。臨床廣泛使用的調(diào)脂藥非諾貝特能促進(jìn)脂肪酸β氧化，降低血TG，理論上能改善肝臟脂肪沉積，但目前尚無(wú)有利的臨床證據(jù)支持其在NAFLD中的應(yīng)用。胰島素抵抗(IR)在NAFLD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[2]，二甲雙胍作為胰島素增敏劑，主要通過(guò)激活A(yù)MP蛋白激酶AMPK( AMP Activated Potein Kinase) 發(fā)揮作用[3], AMPK是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的調(diào)節(jié)因子[4]，同時(shí)參與了胰島素敏感性的調(diào)節(jié)[5]，在脂代謝中也有重要調(diào)節(jié)作用。本研究擬比較非諾貝特及二甲雙胍對(duì)大鼠NAFLD的作用并探討可能機(jī)制，為NAFLD的治療提供臨床思路。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)分組將48只5周齡180～200g清潔二級(jí)雄性Wistar大鼠(購(gòu)自四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為4組，對(duì)照組12只(Control)給予標(biāo)準(zhǔn)飼料，其中碳水化合物熱卡占61%，脂肪熱卡占11%。剩余36只給予高脂飲食，其中脂肪熱卡占59%，以飽和脂肪酸(豬大油)為主，共16周后隨機(jī)分為3組，分別為高脂飲食組12只(HF組)，繼續(xù)給予高脂飲食；高脂飲食加非諾貝特組12只(FF組)，給予高脂飲食加非諾貝特80mg/kg[6](0.2g/粒，法國(guó)利博福尼制藥公司)，每天定時(shí)灌胃，持續(xù)4周和高脂飲食加鹽酸二甲雙胍組12只(Met組)，給予高脂飲食加鹽酸二甲雙胍50mg/d·kg(0.5g/粒，中美上海施貴寶制藥有限公司),每日定時(shí)灌胃，持續(xù)4周。共20周后稱重、腹腔注射麻醉后，腹腔靜脈取血以制備血清行生化檢測(cè)后處死動(dòng)物，取出肝臟，取肝組織冰凍切片備用，余肝組織在-70℃低溫冰箱保存。

1.2　檢測(cè)方法

1.2.1生化指標(biāo)測(cè)定全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)，葡萄糖氧化酶法測(cè)空腹葡萄糖(GLU)。

1.2.2肝臟組織中TG(Liver-TG)含量測(cè)定大鼠同一部位肝臟組織準(zhǔn)確稱量100mg，加入氯仿一甲醇(1:1)抽提液，組織勻漿，靜置18h后，3000/pm離心10min，上層為水相，吸取下層有機(jī)相，4℃冰凍保存，采用全自動(dòng)生化分析儀，檢測(cè)肝勻漿甘油三醋(TG)。

1.2.3病理切片觀察肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?nèi)「谓M織冰凍切片，行常規(guī)HE染色，觀察肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變。

1.2.4AMPK, PPARα, 乙酰輔酶A羧化酶(ACC), 肉堿酯酰轉(zhuǎn)移酶1(CPT-1)mRNA和蛋白表達(dá)改變采用Trizol試劑提取總RNA，取100mg肝組織，按說(shuō)明書操作，RNA于紫外分光光度計(jì)定量后于-80℃保存。采用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒合成cDNA，按照說(shuō)明書操作。PCR反應(yīng)條件：95℃3min，93℃1min，55℃1min，72℃1min，40個(gè)循環(huán)；72℃10min。于每個(gè)循環(huán)延長(zhǎng)反應(yīng)最后時(shí)刻收集熒光信號(hào)。溶解曲線設(shè)置：95℃1s，60℃2min，以0.2℃/s的升溫速度升溫至95℃，升溫是連續(xù)收集熒光信號(hào)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI Prism 7500 Detection System)檢測(cè)。PCR引物由上海生物工程公司合成，引物設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。

表1　RT-PCR引物設(shè)計(jì).

Western blot方法監(jiān)測(cè)蛋白水平表達(dá)在冰凍緩沖液中研碎肝臟組織，提取蛋白，在4℃20000r/min,離心20min,小心吸取上清，用BCA法，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白擬合曲線，計(jì)算蛋白濃度，確定上樣量。取50μg蛋白在95℃溫度下變性5min，SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜。封閉1h，應(yīng)用AMPKα1，AMPKα2(Abcam)抗體孵育， 加5ulⅡ抗(1∶2000稀釋)與10ml封閉緩沖液中充分混勻，加入硝纖膜，吸干過(guò)多液體，保鮮膜包裹硝纖膜，置于曝光合中曝光、顯影、定影。GAPDH為內(nèi)參照，用多功能數(shù)字像分析儀Kodak Digital Science ID軟件分析。

1.2.5肝組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定肝組織100mg，常規(guī)4℃制備10%肝勻漿，MDA采用TBA法按試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè)；SOD采用黃嘌呤氧化酶法，按試劑盒操作。

2結(jié)果

2.1血生化檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)表2)大鼠給予高脂飲食喂養(yǎng)4月后，出現(xiàn)明顯的血脂譜升高，TG、CHO 及LDL-C 較正常對(duì)照組分別升高63.1%、45.18%和151.42%(均P<0.01)。FF組較HF組血脂譜有明顯改善(P<0.01)，TG、CHO下降尤為明顯(P<0.05)，與正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；FF組LDL-C也明顯降低，與HF組相比有差異(P<0.05)，但與正常對(duì)照組相比尚高(P<0.05)。同樣，Met組相比HF組，TG, CHO全面下降(P<0.05)；但相比FF組下降幅度較低，尚有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

HF組較對(duì)照組血清葡萄糖水平升高(P<0.05)，F(xiàn)F組與HF組相比血糖無(wú)明顯下降(P>0.05)，Met組與HF組比較血糖明顯下降(P<0.05)，與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

HF組較對(duì)照組血清胰島素水平增加(P<0.01)；FF組較對(duì)照組仍明顯升高(P<0.01)；但與Met組比較胰島素水平明顯降低。

表2　各組大鼠血脂、血糖、空腹胰島素、ALT及肝臟TG含量檢測(cè)結(jié)果比較

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05，②P<0.01;與HF組相比，③P<0.05,④P<0.01;與FF組相比，⑤P<0.05,⑥P<0.01

2.2肝臟形態(tài)學(xué)改變對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細(xì)胞分界清晰，細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)明顯脂滴，形態(tài)未見(jiàn)異常(見(jiàn)圖1a)。高脂飲食的HF組肝小葉結(jié)構(gòu)不清，肝細(xì)胞索紊亂，肝細(xì)胞廣泛濁腫變性，細(xì)胞氣球樣變，胞漿內(nèi)小脂滴形成(見(jiàn)圖1b)。高脂飲食的FF組肝小葉鏡下形態(tài)相似于高脂飲食組，肝細(xì)胞腫脹變性、細(xì)胞內(nèi)脂滴形成，可見(jiàn)少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)(見(jiàn)圖1c)。高脂飲食的Met組肝小葉結(jié)構(gòu)較完整，相似于正常對(duì)照組，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，但小灶區(qū)域仍可見(jiàn)肝細(xì)胞索輕度紊亂，肝細(xì)胞輕度水腫(見(jiàn)圖1d)。

2.3各組大鼠肝臟TG含量高脂喂養(yǎng)后大鼠肝臟TG含量明顯增加(P<0.05)；但給予非諾貝特后雖然血中TG含量明顯下降，肝組織中TG含量與HF組相比無(wú)明顯改善(P>0.05)；而給予二甲雙胍后肝臟中TG明顯減少，接近正常飲食組，與HF組及FF組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.4各組大鼠MDA和SOD含量高脂飲食增加MDA含量，HF組與對(duì)照及HF組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，二甲雙胍能降低高脂飲食誘導(dǎo)的MDA含量的上升Met組，與HF組及FF組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

高脂飲食及非諾貝特均降低SOD含量，二甲雙胍能基本恢復(fù)高脂飲食導(dǎo)致的SOD的下降，Met組與HF組及FF組相比差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3　各組大鼠MDA和SOD含量比較

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05;與HF組相比，②P<0.05;與FF組相比，③P<0.05

圖1肝臟的形態(tài)學(xué)改變(HE染色，×400)

Figure 1Morphological changes of the liver

注：a.正常對(duì)照;b.HF組：細(xì)胞腫脹、胞漿內(nèi)脂滴形成;c. FF組：細(xì)胞腫脹、胞漿內(nèi)脂滴形成，可見(jiàn)少量炎性細(xì)胞;d. Met組：細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，但箭頭處仍可見(jiàn)小灶區(qū)域肝細(xì)胞輕度水腫。

2.5RT-PCR檢測(cè)AMPKmRNA、 PPARαmRNA、 ACCmRNA和CPT-1mRNA表達(dá)ACC是催化脂肪酸合成代謝第一步反應(yīng)的限速酶，是評(píng)估脂肪酸合成代謝的重要酶；CPT-1催化脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體基質(zhì)進(jìn)行β氧化，是脂肪酸氧化分解的限速酶。本實(shí)驗(yàn)選擇ACC和CPT-1分別作為脂肪酸合成和分解代謝的指標(biāo)，見(jiàn)圖2。

2.5.1AMPKα1mRNA在各組的變化與對(duì)照組比較，高脂飲食能明顯降低其表達(dá)(P<0.05)；非諾貝特能部分恢復(fù)單純高脂飲食導(dǎo)致的改變，但與HF及對(duì)照組相比均未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而二甲雙胍則能更顯著的引起表達(dá)的上升，與HF組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.5.2AMPKα2mRNA在各組的變化HF組與對(duì)照相比無(wú)明顯變化(P>0.05), 但FF組相比對(duì)照及HF組均升高(P<0.05);二甲雙胍引起更顯著的升高，與對(duì)照、HF及FF組相比均P<0.01。

2.5.3PPARαmRNA在各組的變化與對(duì)照相比，高脂飲食能增加其表達(dá)(P<0.01)，而FF組增加更為顯著，與正常對(duì)照及HF組相比分別P<0.01、P<0.05；二甲雙胍也能增加表達(dá)量，與正常對(duì)照及HF組相比分別P<0.01、P<0.05，但相較FF組有所降低(P<0.05)。

2.5.4ACCmRNA在各組的變化高脂飲食能明顯增加其表達(dá)量，相比對(duì)照組(P<0.05)；菲諾貝特能部分恢復(fù)其表達(dá)，但與HF相比未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；而二甲雙胍明顯恢復(fù)其表達(dá)量，與對(duì)照相比無(wú)差異，與HF相比P<0.05。

2.5.5CPT-1mRNA在各組的表達(dá)高脂飲食降低其表達(dá)(P<0.05)；FF組與對(duì)照及HF組相比分別P<0.05、P<0.01；二甲雙胍相比對(duì)照無(wú)差異，相比FF組有所降低，與HF及FF組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.6Western blotting方法監(jiān)測(cè)蛋白水平表達(dá),見(jiàn)圖3。

2.6.1AMPKα1高脂飲食能降低其表達(dá)；相比HF組，F(xiàn)F組及Met組均能升高其表達(dá)(P<0.05),Met組升高更顯著，與對(duì)照組及FF組相比(P<0.05)。

2.6.2AMPKα2高脂飲食能顯著降低其表達(dá)，相比HF組，F(xiàn)F組及Met組均能升高其表達(dá)(P<0.05)，但FF組尚未達(dá)到對(duì)照組水平(P<0.05)，而Met組與對(duì)照無(wú)差異，與HF組及FF組相比均明顯升高(P<0.05)。

圖2RT-PCR檢測(cè)各組大鼠肝臟AMPKα1、AMPKα2、PPARα、ACC、CPT-1的mRNA相對(duì)表達(dá)

Figure 2The relative mRNA levels of AMPKα1，AMPKα2，PPARα，ACC and CPT-1 by RT-PCR

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05，②P<0.01；與HF組相比，③P<0.05,④P<0.01；與FF組相比，⑤P<0.05

2.6.3PPARα高脂飲食能升高其表達(dá)相比HF組，F(xiàn)F組及Met組其表達(dá)進(jìn)一步升高，分別為P<0.01和P<0.05，Met相比FF組有所下降(P<0.05)。

2.6.4ACC高脂飲食增加ACC蛋白表達(dá)；與HF組相比，F(xiàn)F組及Met組表達(dá)均下降(P<0.05)，Met組進(jìn)一步降低，與FF組相比表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.6.5CPT-1高脂飲食降低CPT-1蛋白表達(dá)；FF組及Met組升高其表達(dá)，與HF組相比，分別為P<0.01和P<0.05；FF組升高更為明顯，相比Met組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3Western-blot檢測(cè)各組大鼠肝臟AMPKα1、AMPKα2、PPARα、ACC、CPT-1的蛋白表達(dá)

Figure 3The protein expressions of AMPKα1，AMPKα2，PPARα，ACC and CPT-1 by Western-blot

注：與對(duì)照組相比，①P<0.05，②P<0.01;與HF組相比，③P<0.05或P<0.01;與FF組相比，④P<0.05

3討論

NAFLD隨著肥胖、脂代謝紊亂等的流行，已成為肝功能異常、慢性肝臟疾病最常見(jiàn)的原因[7，8]。其發(fā)病率有年輕化趨勢(shì)，患病率在10%左右[9]。其病理改變從最初的單純肝脂肪變可進(jìn)展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、最終可致肝硬化、肝癌[1]。其典型病理特征為大量中性脂質(zhì)，尤其是甘油三酯(TG)在肝細(xì)胞的沉積而導(dǎo)致的肝細(xì)胞脂肪變性，以及過(guò)量脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)導(dǎo)致的肝細(xì)胞炎癥及纖維化等改變。肝臟的脂質(zhì)沉積及IR在NAFLD的發(fā)病中有著重要作用，大量的資料證實(shí)，高脂環(huán)境可以損害包括肝臟、骨骼肌、脂肪組織等在內(nèi)的胰島素靶器官對(duì)胰島素和敏感性[10]，在肝臟則引起肝臟組織的IR，是NAFLD的重要原因。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)大鼠4月，使大鼠血TG, CHO,LDL-C全面升高，血ALT升高，空腹胰島素水平升高，提示IR的存在；此外，肝臟病理學(xué)檢查提示肝細(xì)胞脂肪變性，提示成功誘導(dǎo)NAFLD動(dòng)物模型。

盡管NAFLD進(jìn)展緩慢，但隨訪10～20年NASH患者肝硬化的發(fā)生率高達(dá)15%～29%[11,12],且部分可進(jìn)展為肝細(xì)胞肝癌,故及早防治NAFLD具有重要意義。但遺憾的是目前尚無(wú)有確切證據(jù)的NAFLD治療藥物，Oh MK[8]綜述了目前的幾種針對(duì)NAFLD可能有潛在治療作用的藥物的臨床實(shí)驗(yàn)，其中包括二甲雙胍及PPARα配體類藥物，提示二甲雙胍可能對(duì)NAFLD有治療作用，但缺乏大樣本的臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；而調(diào)脂藥物由于缺乏臨床數(shù)據(jù)，對(duì)NAFLD的治療尚不明確。有研究[13]提示非諾貝特雖能明顯改善NAFLD患者的血脂譜，甚至能降低轉(zhuǎn)氨酶，但NAFLD的程度并未得到改善。Bajaj M[14]發(fā)現(xiàn)吡格列酮能降低Ⅱ型糖尿病患者肝臟脂肪含量，而非諾貝特并無(wú)此作用。臨床研究顯示二甲雙胍能改善NAFLD患者的胰島素抵抗，降低ALT,AST，減小肝臟體積[15]。上述實(shí)驗(yàn)提示提示對(duì)于改善肝臟脂質(zhì)沉積而言提高胰島素敏感性可能較改善血脂譜更重要。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高脂飲食加二甲雙胍能改善單純高脂飲食誘導(dǎo)的血脂譜的升高，降低血ALT水平，降低血胰島素水平；同時(shí)能降低肝組織中的TG含量；此外，通過(guò)病理學(xué)的證據(jù)也證實(shí)，相比較單純高脂飲食組，高脂飲食加二甲雙胍能改善肝臟病理形態(tài)，減少肝臟組織中TG含量，減輕肝臟脂質(zhì)沉積。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二甲雙胍對(duì)NAFLD有治療作用。而相比較單純高脂飲食，高脂飲食加非諾貝特雖能全面降低血中的TG、CHO、LDL-C,但肝臟中的TG含量并未改善，ALT水平無(wú)變化，空腹胰島素水平無(wú)改善，病理學(xué)檢查提示肝細(xì)胞脂肪變性無(wú)改善，炎癥改變似乎更明顯。上述結(jié)果提示非諾貝特雖能降低血脂，但并不能改善IR, 不能減輕肝臟脂肪沉積及NAFLD。二甲雙胍及非諾貝特均能改善血脂。

二甲雙胍作為一種臨床應(yīng)用已有50余年歷史的降糖藥物，其主要作用為改善胰島素敏感性，特別是肝臟和肌肉組織的IR，其藥理學(xué)機(jī)制主要是經(jīng)由AMPK途徑調(diào)節(jié)體內(nèi)糖及脂質(zhì)代謝，由Zhou等[16]首次發(fā)現(xiàn)。其實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在大鼠離體肝臟細(xì)胞和骨骼肌組織中，二甲雙胍可以激活A(yù)MPK，使AMPK底物乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)活性降低，增加脂肪酸氧化，抑制脂肪合成，促進(jìn)骨骼肌的葡萄糖攝取。后來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)AMPK是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的重要調(diào)控因子，可通過(guò)感受ATP/AMP的變化來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)糖及脂肪的代謝[17,18]，研究發(fā)現(xiàn)[19]其與糖脂代謝紊亂有關(guān)的疾病如代謝綜合征、Ⅱ型糖尿病、肥胖、FAFLD等疾病密切相關(guān)。AMPK與胰島素敏感性密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)，肥胖的IR患者較同樣肥胖的非IR患者AMPK活性降低，氧化應(yīng)激水平增高，提示激活A(yù)MPK可以改善IR，降低氧化應(yīng)激。PPARα是脂肪酸氧化調(diào)節(jié)的重要因子，近年來(lái)認(rèn)為AMPK與PPARα之間存在一定聯(lián)系[20]，二者均參與了脂代謝過(guò)程中的一些重要酶的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，二甲雙胍能增加明顯肝臟組織中AMPKα1、2的mRNA的改變，改善高脂飲食誘導(dǎo)的AMPK1、2蛋白表達(dá)的下降，相較非諾貝特而言輕度增加PPARαmRNA及蛋白表達(dá)；此外，促進(jìn)脂肪合成的酶ACCmRNA及其蛋白表達(dá)水平均下降，而促進(jìn)脂肪分解的CPT-1mRNA及其蛋白表達(dá)均升高，提示二甲雙胍對(duì)NAFLD的改善可能源于對(duì)脂肪合成的抑制以及對(duì)脂肪分解的增強(qiáng)，而脂肪代謝的改變可能與其對(duì)AMPK及PPARα的調(diào)節(jié)有關(guān)。

非諾貝特作為過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)的配體，通過(guò)激活PPARα，增強(qiáng)脂肪酸的氧化，理論上能抑制TG在肝臟的聚集，改善NAFLD。Motawi TM等[21]發(fā)現(xiàn)非諾貝特同時(shí)也能激活高脂飲食喂養(yǎng)的大鼠的肝臟AMPK1α的表達(dá)，上調(diào)CPT-1mRNA的表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸氧化，降低血脂質(zhì)譜，但并未觀察肝臟病理形態(tài)上的改變。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)非諾貝特不能改善肝臟病理形態(tài)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，非諾貝特導(dǎo)致的的AMPKα1和2的mRNA及蛋白水平較HF組雖有所增加，但不及二甲雙胍組明顯，而PPARαmRNA及蛋白水平卻比二甲雙胍組更明顯，促進(jìn)脂肪分解的CPT-1的表達(dá)遠(yuǎn)較二甲雙胍增高明顯，而促進(jìn)脂肪合成的ACC的下降則不如二甲雙胍明顯。通過(guò)上述對(duì)比不難發(fā)現(xiàn)，非諾貝特較二甲雙胍激活PPARα的能力更強(qiáng)，更能促進(jìn)脂肪分解，脂肪合成抑制作用相對(duì)較弱，提示非諾貝特組存在脂肪過(guò)度分解，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)，可能與非諾貝特組的肝臟病理學(xué)形態(tài)改變有關(guān)。Chitturi 等[22]認(rèn)為，PPAR 活化后會(huì)導(dǎo)致脂肪性肝炎的發(fā)生; Nishimura J等[23]也發(fā)現(xiàn)非諾貝特能增加CPT等活性，促進(jìn)脂肪分解，但同時(shí)劑量依賴性地增加肝臟ROS含量，降低SOD水平，從而促進(jìn)脂肪性肝炎的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)也監(jiān)測(cè)了血中的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA及抗氧化物SOD水平，結(jié)果提示高脂飲食能明顯增加肝臟MDA含量，降低SOD含量，F(xiàn)F組較HF組MDA含量進(jìn)一步升高，而二甲雙胍較非諾貝特能明顯降低MDA含量，增加SOD。上述結(jié)果提示FF組脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的存在，二甲雙胍能部分糾正單純高脂飲食的脂質(zhì)過(guò)氧化狀態(tài)，與肝臟病理學(xué)形態(tài)結(jié)果相一致。

4結(jié)論

本文結(jié)果顯示，非諾貝特不能改善高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD，可能與PPARα過(guò)度激活，導(dǎo)致脂肪分解增強(qiáng)，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的出現(xiàn)；而二甲雙胍能適當(dāng)調(diào)節(jié)AMPK及PPARα的活性，改善IR，抑制脂肪合成，還可促進(jìn)脂肪分解，避免肝臟脂肪沉積，同時(shí)避免脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的出現(xiàn)，從而改善NAFLD。

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