鄧麗麗，李德龍 ，蔡年輝 ，周 軍 ，孫 琪 ，唐紅燕 ，王大瑋 ，許玉蘭

（1. 西南林業(yè)大學 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 普洱市林業(yè)科學研究所，云南 普洱 665099）

基于高通量測序的思茅松微衛(wèi)星位點的特征分析

鄧麗麗1，李德龍1，蔡年輝1，周 軍1，孫 琪1，唐紅燕2，王大瑋1，許玉蘭1

（1. 西南林業(yè)大學 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室，云南 昆明 650224；2. 普洱市林業(yè)科學研究所，云南 普洱 665099）

以思茅松針葉為材料，采用Illumina Hiseq2000平臺測序，得到121 882條無冗余的序列，對這些序列進行SSR位點搜索，共獲得3534個SSR位點，出現(xiàn)頻率為2.9%，分布平均距離25kb。所搜索的SSR以單核苷酸重復類型最多，其次為三核苷酸和二核苷酸，而四、五、六核苷酸重復類型較少（＜1%）。單核苷酸重復類型中以A/T基元較豐富（43.58%）；二核苷酸中出現(xiàn)頻率最高的是AT/TA基元（14.04%），AG/CT次之，AC/GT和CG/CG較低；三核苷酸重復類型中AAG/CTT最多，AGC/CTG和AGG/CCT次之，以CCG/CGG、ACG/CGT和ACT/AGT較少（＜1%）；四、五、六核苷酸類型中各重復基元相差不大，均較少。SSR數(shù)量隨對應的重復類型重復次數(shù)的增加而降低，也隨重復區(qū)段堿基長度的增加而降低。

思茅松；高通量測序；微衛(wèi)星

思茅松Pinus kesiyavar.langbianensis(A. Chev.)Gaussen是卡西亞松P.kesiyaKoyle ex Gordon的一個地理變種[1]，在我國分布于云南省亞熱帶、準熱帶地區(qū)，是主要用材樹種[2]。自20世紀80年代以來對思茅松的遺傳改良做了許多工作，取得了階段性的成果和成熟的經(jīng)驗[3]。目前，有關思茅松苗木培育[4]、森林資源管理[5]、遺傳變異[6]等方面開展多方位的研究，而從分子水平開展研究不多，集中在實驗方法的建立[7-9]，利用分子標記對種質資源的評價研究更為鮮見，僅有少數(shù)利用同工酶及RAPD開展天然種群及種子園遺傳多樣性的研究[10-11]，迄今為止對思茅松的遺傳多樣性和遺傳結構的了解仍十分欠缺，缺乏系統(tǒng)的遺傳學、群體遺傳學等基礎研究工作，僅局限于部分地區(qū)的有限群體或種子園，而且所選用的檢測手段以表型或顯性標記為主，信息含量較少。因此，從DNA水平上深入研究思茅松群體遺傳結構與分化就顯得更為重要，可為該種質資源的保護與利用提供科學指導。

微衛(wèi)星是一種共顯性的分子標記，因其多態(tài)性豐富、重復性高、覆蓋面廣、易于檢測、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，廣泛應用于遺傳多樣性分析、親緣關系分析、品種鑒定和輔助選擇育種等方面[12-19]。盡管微衛(wèi)星在許多在很多領域中得到廣泛應用，但存在微衛(wèi)星的分離問題[20]。傳統(tǒng)的方法是先構建文庫，再采用探針對所建立的文庫進行篩選[21]，該方法耗時、耗力，且效率低，后來研究者相繼提出一些改進的方法，如選擇性雜交、磁珠富集等，這些方法很快就取代傳統(tǒng)的耗時耗力的建庫掃描的方法[20]。近年來隨著高通量測序技術的發(fā)展，EST序列開發(fā)SSR分子標記也越來越多，是一個比較有效的途徑[22-24]，與基因組SSR相比，EST-SSR具有通用性好、開發(fā)簡便等特點，且來源于基因編碼序列，獲得基因表達信息，可開展功能基因的直接鑒定[25]，這方面的研究也越來越受到人們的關注。但是，目前關于思茅松基于EST序列的SSR研究未見報道。鑒于此，本研究基于Illumina Hiseq 2000平臺對思茅松轉錄組測序，搜索并分析SSR位點信息與分布特征，為思茅松微衛(wèi)星分子標記的開發(fā)提供信息，以豐富思茅松分子標記信息，為分子水平上深入研究思茅松遺傳變異奠定基礎，同時也可為近緣種特種SSR標記開發(fā)及其遺傳分析提供便利。

1 材料與方法

1.1 研究材料

采集思茅松植株當年生幼嫩針葉，干冰保存，核酸提取、測序（Illumina Hiseq2000）與組裝（Trinity軟件）由北京華諾時代科技有限公司完成。

1.2 SSR位點的搜索與統(tǒng)計

使 用 Micro Satellite（MISA,http://pgrc.ipkgatersleben. de/misa/）搜索轉錄組序列中潛在的1～6 bp的SSR，搜索標準為：單核苷酸至少重復10次、二至四核苷酸至少重復5次、五核苷酸和六核苷酸至少重復4次。采用Excel軟件統(tǒng)計SSR的數(shù)量、出現(xiàn)頻率、分布距離與密度、重復類型、基元組成、重復區(qū)段長度變化等，分析思茅松轉錄組SSR的分布特征。

2 結果與分析

2.1 思茅松轉錄組微衛(wèi)星序列的分布豐度與距離

組裝獲得的思茅松轉錄組共121 882條無冗余的轉錄本序列，按標準搜索1～6 bp的SSR，共搜索到3 534個SSR位點，其中復合型SSR的數(shù)量為96個，分布于3205條序列上，發(fā)生頻率（含SSR序列數(shù)/總序列數(shù)）為2.63%，其中2 924條序列含有單個SSR，281條序列含有2個或2個以上的SSR，總的SSR序列出現(xiàn)頻率（檢出的SSR個數(shù)/總序列數(shù)）為2.90%，平均距離為25.12 kb，即每25.12 kb出現(xiàn)1個SSR位點（表1）。

表1 思茅松轉錄組SSR位點的分布Table 1 The distribution of SSR repeat types in Piuns kesiya var. langbianensis transcriptome

在所搜索到的SSR中單核苷酸重復類型所占比例較高（44.74%），三核苷酸重復類型占總數(shù)的29.68%，二核苷酸重復類型占總數(shù)的23.80%，而四、五、六核苷酸重復單元所占比例均較低，分別為0.03%、0.01%和0.01%；若不考慮單核苷酸的情況下，二、三核苷酸占總數(shù)的96.77%。相應地各重復單元類型的出現(xiàn)頻率、分布密度與SSR含量的變化規(guī)律相同，表現(xiàn)為：單核苷酸＞三核苷酸＞二核苷酸＞四核苷酸＞五核苷酸＞六核苷酸；不同重復類型核苷酸的平均距離各不相同，其順序依次為：單核苷酸＜三核苷酸＜二核苷酸＜四核苷酸＜五核苷酸＜六核苷酸，其中單核苷酸與六核苷酸重復類型的分布距離差異達113倍，即該轉錄組序列中每出現(xiàn)113個單核苷酸重復類型才出現(xiàn)一個六核苷酸重復類型的SSR。由表也可以看出，不同重復類型SSR位點的出現(xiàn)頻率或數(shù)量越高，其平均距離越小，分布密度越大。

2.2 思茅松轉錄組微衛(wèi)星序列的重復基元類型和比例

思茅松轉錄組微衛(wèi)星序列各重復基元統(tǒng)計如表2所示。

不同核苷酸重復類型的重復基元所占的比例差異較大，單核苷酸重復類型中以A/T基元居多，占43.58%，而C/G較少，僅占總數(shù)的1.16%；二核苷酸重復類型中各基元所占比例依次為：AT/AT（14.04%）＞AG/CT（8.09%）＞AC/GT（1.61%）＞CG/CG（0.06%）；三核苷酸重復類型中AAG/CTT較多（6.28%），其次是AGC/CTG（5.69%）和AGG/CCT（4.73%），而以ACT/AGT、ACG/CGT和CCG/CGG較低（＜1%）；四核苷酸重復類型中共搜索到20種重復基元，各重復基元的比例較低，最高的僅為0.14%；五、六核苷酸中出現(xiàn)的基元種類少、比例低。四、五、六核苷酸中各重復基元出現(xiàn)的頻率均比較低，因此表2中未列出具體的基元類型。

表2 思茅松轉錄組SSR各重復基元及其比例Table 2 The relative percentage of SSR repeat motif in Piuns kesiya var. langbianensis transcriptome

2.3 思茅松轉錄組微衛(wèi)星序列重復次數(shù)

重復基元的重復次數(shù)變異引起重復片段序列長度的變異，思茅松轉錄組微衛(wèi)星序列各重復類型的SSR重復次數(shù)如圖1所示。

圖1 思茅松轉錄組各微衛(wèi)星重復類型重復次數(shù)分布頻率Fig.1 Frequency of SSR repeat types for the various number of repeats in Piuns kesiya var. langbianensis transcriptome

由圖1可知，各重復類型的重復次數(shù)差異較大，波動于5～24次，總體表現(xiàn)為重復次數(shù)隨重復單元中核苷酸數(shù)量的增加而減少，其中單核苷酸重復10～23次，二核苷酸重復6～13次、其余核苷酸重復5～9次，不同核苷酸重復類型主導的重復次數(shù)也不相同。由圖也可以看出，SSR出現(xiàn)的頻率隨重復次數(shù)的增加而降低；與此同時，隨著SSR重復類型堿基數(shù)的增加，重復次數(shù)減少?？傮w來看（見圖2），SSR的重復次數(shù)以5～10次占多數(shù)，占77.31%，11～15次的占18.08%，而重復次數(shù)在15次以上的不足5%，表現(xiàn)為隨著重復次數(shù)的增加，SSR數(shù)量呈降低的趨勢。

2.4 思茅松轉錄組微衛(wèi)星序列長度分布

思茅松轉錄組SSR重復片段的長度波動于10～76 bp，其中以10～24 bp居多（見圖3）。由圖3和表1可知，單核苷酸重復類型的長度和二核苷酸重復類型的長度均變化于10～24 bp，平均長度分別為11.75 bp和14.53 bp；三核苷酸重復類型變化于15～27 bp，平均長度為16.35 bp；四核苷酸重復類型長度20～24 bp，另有一個重復較高的，重復19次（76 bp），平均長度為22.24 bp；五核苷酸重復類型長度25～40 bp，平均26.67 bp；六核苷酸30～66 bp，平均37.29 bp。綜合來看，各重復區(qū)段堿基片段長度變化表現(xiàn)為隨著重復類型堿基數(shù)的增加，片段的平均長度也隨之增加，即從單核苷酸至六核核苷酸，片段的平均長度呈遞增的趨勢（表1）。從圖3也可以看出，除六核苷酸外，其余核苷酸的重復類型表現(xiàn)為SSR出現(xiàn)的頻率隨重復區(qū)段堿基片段長度的增加而降低，微衛(wèi)星重復區(qū)段片段長度與其對應的SSR數(shù)量或比例成相反的變化趨勢，即重復區(qū)段堿基片段短的，其SSR數(shù)目較多。從全部核苷酸來看，90%以上的重復區(qū)段片段長度為10～20 bp，而大于30 bp的SSR不足1%。

圖2 思茅松轉錄組微衛(wèi)星重復次數(shù)分布頻率Fig.2 Frequency of repeat number of SSR in Piuns kesiya var. langbianensis transcriptome

圖3 思茅松轉錄組各SSR重復類型片段長度分布頻率Fig.3 Frequency of SSR repeat types for the various sequence length in Piuns kesiya var. langbianensis transcriptome

3 結論與討論

思茅松轉錄組中SSR的發(fā)生頻率為2.63%，平均分布距離為25.12 kb，39個SSR/Mb，與云南松Pinus yunnanensis轉錄組中SSR的分布及發(fā)生頻率較為接近[26]，而與楊樹Populus（14.83%）、桉樹Eucalyptus（14.99%）的發(fā)生頻率相比較低[27-28]，這種差異大小可能與SSR搜索標準、數(shù)據(jù)庫大小以及物種有關[29]，也可能與含有微衛(wèi)星的基因的表達豐度有關[27]。思茅松轉錄組序列所檢測的SSR中，單核苷酸重復類型所占比例接近一半，另一半主要是由三核苷酸重復類型和二核苷酸重復類型組成，這在紅松Pinus koraiensis轉錄組的研究中也提到，單核苷酸重復類型占總的46.90%[30]，楊樹轉錄組檢測到的核苷酸也表現(xiàn)出相同的規(guī)律，即單核苷酸＞三核苷酸＞二核苷酸[31]，但在云南松轉錄組中以三核苷酸較多[26]，這種占優(yōu)勢的重復類型在不同植物中有所差異，許玉蘭等[32]對多物種的統(tǒng)計可知以二、三核苷酸較為集中。若不考慮單核苷酸的情況下，在2～6 bp的SSR中，思茅松也以2～3 bp重復類型為主，這在地中海松Pinus halepensis、馬尾松Pinus massoniana和火炬松Pinus taeda等研究中也有類似的報道[22,33-35]。不同重復類型的SSR多態(tài)水平存在一定的差異[36]，在研究報道中，擴增出多態(tài)性位點的引物重復單元以二、三核苷酸重復為主[30,37-38]，李淑嫻等[27]在桉樹研究中也發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星長度的變異速率與其長度之間存在一定的關系，表現(xiàn)為低級基元SSR理論多態(tài)性較高[39]。因此，思茅松轉錄組含有較多低級基元單、二、三核苷酸，多態(tài)性SSR分子標記的開發(fā)具有很大的潛力。

不同重復類型中各重復基元所在比例存在差異，在單核苷酸重復類型中，以A/T占絕多數(shù)，二核苷酸重復類型中，AT/TA占多數(shù)，表現(xiàn)出AT優(yōu)勢。這種現(xiàn)象在云南松[26]、紅松[30]、火炬松和馬尾松[33]中均有研究報道。AT含量較多可能與其能量有關，因為A-T間為兩氫鍵，C-G間為三氫鍵，打破AT所需的能量低于CG[40]。但是，在三核苷酸重復類型中以AAG/CTT、AGC/CTG和AGG/CCT較多，分別為6.28%、5.69%和4.73%，與其它的松樹報道的比較相似，如紅松中以AGC/CTG、AGG/CCT和AAG/CTT三種較多，分別占總數(shù)的7.63%、6.66%和6.55%[30]；云南松中也以AGC/CTG、AAG/CTT和AGG/CCT[26]。在前期對多樹種的統(tǒng)計中也可看出以AAG、AGC和AGG較多，而在如檉柳Tamarixspp.、橡膠樹Hevea brasiliensis、白樺Betula platyphylla等中還出現(xiàn)少量其它優(yōu)勢基元，如AAT、AGA、TCA等[32]，表明不同植物SSR基元組成存在一定的差異，但一些優(yōu)勢基元如AAG、AGC和AGG在多種植物中均存在。因此，推測這些重復基元可能在EST序列中的存在較為普遍，可能是優(yōu)勢的蛋白和DNA家族[36]。CG重復單元可能與某些特定的功能相關[41]，在思茅松轉錄組中發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的CG，如二核苷酸CG，三核苷酸ACG、AGC等，這些重復類型是否能加其它的生命活動需要進一步的研究。但是CG的含量很少，有研究認為CG重復類型少是因為基因組DNA中的CpG甲基化，極易發(fā)生突變，較少的GC是維持熱力學穩(wěn)定必須的因素[42]，這些將為思茅松SSR引物的開發(fā)提供啟示。

微衛(wèi)星位點多態(tài)性主要原因是基元重復數(shù)和堿基數(shù)不同而形成的序列長度多態(tài)性[43]，微衛(wèi)星核心序列重復次數(shù)與該位點等位基因數(shù)存在較強的正相關，一般重復次數(shù)多，其變異性越大，該位點的等位基因數(shù)越多[41]，思茅松轉錄組SSR豐度隨各對應重復類型堿基數(shù)的增加而減少，這在其它的研究中也有類似的報道，如唐古特紅景天Rhodiola algida中核苷酸類型表現(xiàn)為長度變化與其對應的重復類型的堿基長度成反比，同種重復類型中，微衛(wèi)星的長度與對應的SSR數(shù)成反比[41]。云南松中也出現(xiàn)隨著重復次數(shù)的增加、重復片段的增長，SSR出現(xiàn)的數(shù)量降低[26]。由此表明，這種重復類型特征不是思茅松所特有。一般來說，重復區(qū)段堿基片段長度隨著重復次數(shù)的不同而發(fā)生變化，而SSR長度變異是產(chǎn)生SSR多態(tài)性的主要原因[39]，不同長度微衛(wèi)星的分布及變化的分析有利于多態(tài)性高的SSR標記的獲得[41]。從思茅松轉錄組SSR分析來看，重復次數(shù)為5～24次，其中單核苷酸因容易發(fā)生錯配排除外[43]，其余的核苷酸重復類型重復次數(shù)也有5～13次，甚至有高達19次的。從片段長度來看，90%的長度≤20 bp，按照Temnykh等[39]的提出SSR長度≤20 bp時多態(tài)性高，當＞20 bp時，仍以低級基元類型為主（72.94%），這部分SSR可能也具有較多的多態(tài)性潛能。由此推測，思茅松轉錄組挖掘的3 534個SSR位點大部分具有多態(tài)性潛能，可用于分子標記的開發(fā)。當然，本研究僅針對SSR位點分布特征進行分析，對于引物的開發(fā)以及功能標記的研究還需入進一步深入。

4 小 結

思茅松轉錄組SSR出現(xiàn)頻率較高，類型豐富，且分布密度也較大。在搜索到的3 534個SSR位點中，以單核苷酸占多數(shù)，其次為三、二核苷酸重復類型，而四、五、六核苷酸重復類型的SSR數(shù)量較少。單核苷酸和二核苷酸重復類型中，以A/T、AT/TA基元出現(xiàn)的比例較高，CG含量相對較低。SSR位點出現(xiàn)的頻率越高，其平均距離越??；各重復單元片段長度變隨著重復單元堿基數(shù)的增加而增加；SSR出現(xiàn)的頻率隨對應重復類型重復區(qū)段堿基片段長度的增加而降低；同樣地，隨著重復次數(shù)的增加，SSR數(shù)量呈降低的趨勢。結合其它研究，評價思茅松轉錄組所挖掘的3 534個SSR位點具有較高多態(tài)性潛能，可用于分子標記的開發(fā)。

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Characteristic analysis of microsatellite inPinus kesiyavar.langbianensisby using high-throughput sequencing

DENG Li-li1, LI De-long1, CAI Nian-hui1, ZHOU Jun1, SUN Qi1, TANG Hong-yan2, WANG Da-wei1, XU Yu-lan1
(1. Key Laboratory for Forest Genetic and Tree Improvement & Propagation in Universities of Yunnan Province, Southwest Forestry University, Kunming 650224, Yunnan, China；2. Puer City Institute of Forestry Sciences, Puer 665099, Yunnan, China)

Needle sample ofPinus kesiyavar.langbianensiswas sequenced with high-throughput sequencing technology (Illumina Hiseq 2000). In total 121 882 transcripts ofPinus kesiyavar.langbianensis.were screened using MISA software. 3534 SSRs were identi fied, and the frequency of SSR was 2.9% and mean distribution density was 25 kb. The mono-nucleotide repeats were the highest,followed by tri-nucleotide and di-nucleotide repeat types. The tetra-nucleotide, petra-nucleotide and hexa-nucleotide were all less than 1%.Among the mononucleotide repeats, the A/T repeats motifs were the highest frequency (43.58%). AT/AT was the most frequent repeat motifs in di-nucleotide repeats (14.04%), followed by AG/CT. AC/GT and CG/CG were minimum. AAG/CTT repeats motifs was the highest in tri-nucleotide followed by AGC/CTG and AGG/CCT, while CCG/CGG, ACG/CGT and ACT/AGT were lowest (＜1%). The repeat motifs were very few in tetra-nucleotide, petra-nucleotide and hexa-nucleotide and had no obvious differences. The SSR number of decreased with the increased number of repeats and length of repeats.

Pinus kesiyavar.langbianensis; high-throughput sequencing; microsatellite

S791.259

A

1673-923X(2016)10-0072-06

10.14067/j.cnki.1673-923x.2016.10.013

2016-01-19

西南林業(yè)大學科技創(chuàng)新基金（15092）；國家自然科學基金項目（31500536）；西南林業(yè)大學科研啟動基金項目（01102-111436）

鄧麗麗，碩士研究生

許玉蘭，副教授，博士；E-mail：xvyulan@163.com

鄧麗麗，李德龍，蔡年輝，等. 基于高通量測序的思茅松微衛(wèi)星位點的特征分析[J].中南林業(yè)科技大學學報，2016, 36(10):72-77, 93.

[本文編校：吳 彬]