商婷婷 鄺夢(mèng)婷 胡新喜，2 熊興耀，2 陸 英，3

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.湖南省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128；3.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

馬鈴薯作為一種主要的經(jīng)濟(jì)作物在世界范圍內(nèi)廣為種植。馬鈴薯植株和塊根中含有一類甾體類糖苷生物堿，主要為α－茄堿和α－卡茄堿，在芽、幼葉、花、未成熟塊根以及成熟薯皮組織中含量均較高［1］。研究表明，這類糖苷生物堿在體內(nèi)外均具有較強(qiáng)的毒性［2，3］，有抗腫瘤［4］、抗瘧［5，6］、強(qiáng)心［7］、抗病毒［8］、降脂［9］等多種功效，因此，在食品安全和醫(yī)藥開(kāi)發(fā)中都具有重要意義。近年來(lái)的研究［10］還發(fā)現(xiàn)，這類生物堿對(duì)抵御病原菌和病蟲(chóng)害等有一定的作用，能抑制和殺滅某些真菌、細(xì)菌等病原微生物，因此，作為綠色農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)利用方面也具有廣闊前景。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）不依賴樣品的光學(xué)性質(zhì)，任何揮發(fā)性低于流動(dòng)相的樣品均能被檢測(cè)，近年來(lái)被廣泛用于低紫外吸收物質(zhì)的檢測(cè)，同時(shí)ELSD對(duì)物理性質(zhì)相似的物質(zhì)可以給出一致的響應(yīng)和標(biāo)準(zhǔn)曲線［11，12］，可在無(wú)對(duì)照品的情況下，采用另外一種結(jié)構(gòu)相似、含量已知的物質(zhì)作對(duì)照，從而測(cè)定未知物的含量［13］。目前對(duì)馬鈴薯中生物堿含量的測(cè)定主要采用高效液相色譜法（HPLC）［14－18］，在210nm 處進(jìn)行紫外檢測(cè)（UV），由于分子內(nèi)僅存在一個(gè)共軛雙鍵，屬于紫外末端吸收，溶劑對(duì)檢測(cè)的影響較大，基線不穩(wěn)，特別是當(dāng)樣品中生物堿含量低時(shí)，雜質(zhì)干擾顯得尤為嚴(yán)重。同時(shí)，α－卡茄堿標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格昂貴且難以獲得，很多研究?jī)H測(cè)定了α－茄堿的含量，缺乏對(duì)α－卡茄堿的研究報(bào)道。由于α－茄堿和α－卡茄堿具有相同的母核結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)極相似，本試驗(yàn)擬以α－茄堿為標(biāo)準(zhǔn)品，建立HPLC—ELSD同時(shí)檢測(cè)馬鈴薯中兩種主要生物堿的方法，并對(duì)馬鈴薯不同部位含量進(jìn)行測(cè)定，為馬鈴薯中生物堿安全評(píng)價(jià)及開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

α－茄堿標(biāo)樣：純度為99%，北京百靈威有限公司；

乙腈：色譜純，美國(guó)天地公司；

馬鈴薯及莖葉材料：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)湖南省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心提供。馬鈴薯植株采于2014年5月中旬（品種：金湘），于地面上10cm處割下并分別制備莖、葉、葉柄、全株樣品，馬鈴薯削皮約2～3mm厚，肉皮分離，所有鮮樣切成小段或薄片，置60℃烘箱中干燥，粉碎，密閉后置冰箱備用。

1.2 儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：LC－20A型，日本島津公司；

ELSD檢測(cè)器：ELSD－400型，美國(guó)SOFTA公司；

色譜柱：ZORBAX SB－C18（250mm×4.6mm，5μm），美國(guó)安捷倫公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE－52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH型，金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 HPLC—ELSD分析條件 流動(dòng)相 A：0.1%三氟乙酸水溶液；B：乙腈；梯度洗脫：0～20min，25%～35%B；流速1mL/min，柱溫35℃，ELSD霧化管溫度30℃，漂移管溫度98℃，載氣壓力6.90kPa。

1.3.2 α－茄堿標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精密稱取α－茄堿標(biāo)準(zhǔn)品9.90mg用甲醇超聲溶解定容至10mL，制成0.98mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，取5，10μL進(jìn)樣，將該標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋10倍后再取2，5，10，20μL，每個(gè)進(jìn)樣體積重復(fù)進(jìn)樣3次，測(cè)定并記錄峰面積，以進(jìn)樣質(zhì)量（μg）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（x），以化合物的平均峰面積的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，噪音3倍峰高質(zhì)量為檢出線。

1.3.3 α－卡茄堿定量方法 由于ELSD檢測(cè)器對(duì)結(jié)構(gòu)相似的物質(zhì)具有相同的響應(yīng)因子，因此具有相近的線性方程［11，12］，因此在無(wú)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，可采用α－茄堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算α－卡茄堿的含量。

1.3.4 樣品含量測(cè)定 精確稱取樣品1.0g，用100mL 1%甲酸甲醇于70℃回流提取90min，過(guò)濾，薯皮、薯葉提取液定容至100mL，其他部位提取液在50℃下濃縮，定容至25mL，得供試品溶液。樣液過(guò)膜，在1.3.1條件下進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算α－茄堿和α－卡茄堿含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HPLC—ELSD分析條件的確定

文獻(xiàn)［15～18］采用HPLC—UV法測(cè)定α－茄堿的流動(dòng)相為H3PO4水溶液—乙腈，由于H3PO4不具揮發(fā)性，不能作為HPLC—ELSD的流動(dòng)相，因此選用具有揮發(fā)性的三氟乙酸水溶液與乙腈為流動(dòng)相，同時(shí)考慮到色譜柱的pH耐受值，確定水溶液中三氟乙酸的用量為0.1%。本試驗(yàn)首先考察并優(yōu)化了漂移管溫度、載氣壓力對(duì)色譜峰分離的影響，結(jié)果表明漂移管溫度升高，流動(dòng)相蒸發(fā)趨于完全，信號(hào)響應(yīng)值變大，但溫度過(guò)高，信號(hào)響應(yīng)值變小，當(dāng)漂移管溫度為98℃時(shí)信號(hào)響應(yīng)值最大；載氣壓力不同使載氣流速不同，載氣流速影響霧化器中液滴的形成，從而影響檢測(cè)器的響應(yīng)，載氣壓力為6.90kPa時(shí)，噪聲信號(hào)小，色譜圖基線平穩(wěn)，目標(biāo)組分響應(yīng)值高。同時(shí)通過(guò)洗脫梯度的調(diào)整，在1.3.1色譜條件下兩目標(biāo)組分分離良好，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物確定峰1為α－茄堿，根據(jù)文獻(xiàn)［14］確定峰2為α－卡茄堿，見(jiàn)圖1。

圖1 α－茄堿及馬鈴薯皮提取液的HPLC—ELSD圖譜Figure 1 HPLC—ELSD chromatogram ofα－solanine and the extract of potato skins

2.2 α－茄堿標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按1.3.1方式進(jìn)樣，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)x，峰面積對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)y（圖2）得回歸方程為y＝1.207 9x＋4.807 0，r2＝0.999 5，α－茄堿在0.196～9.800μg線性關(guān)系良好。最低檢出限為0.098μg。

圖2 α－茄堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curve ofα－solanine

2.3 馬鈴薯生物堿提取條件的確定

2.3.1 提取溶劑的選擇 α－茄堿、α－卡茄堿屬于甾體類生物堿，只溶于甲醇、乙醇、吡啶等少數(shù)有機(jī)溶劑中，同時(shí)它們具有弱堿性，能在酸性條件下成鹽增加溶解度。文獻(xiàn)［14～16］均采用酸提堿沉等方式提取及凈化，本試驗(yàn)采用提取液直接進(jìn)樣，不需富集、凈化等復(fù)雜前處理，并考慮ELSD檢測(cè)器對(duì)進(jìn)樣溶液的要求，以馬鈴薯皮為原料，首先考察不同溶劑的提取效果，由表1可知，提取溶劑甲醇優(yōu)于乙醇，甲酸優(yōu)于乙酸，1%甲酸甲醇對(duì)α－茄堿、α－卡茄堿提取效果均最好。

表1 提取溶劑比較Table 1 Comparison of extraction solvent mg/g

2.3.2 提取條件的確定 以馬鈴薯皮為原料，1%甲酸甲醇為提取溶劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)提取溫度、時(shí)間、溶劑用量進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，因素水平表見(jiàn)表2，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知：馬鈴薯生物堿最佳提取條件為A3B3C3。即提取溫度70℃，提取時(shí)間90min，料液比1∶100（m∶V）。由極差分析可知：影響α－茄堿提取效果的因素依次為：時(shí)間＞溫度＞溶劑用量，影響α－卡茄堿提取效果的因素依次為：溶劑用量＞溫度＞時(shí)間，但均無(wú)顯著性差異（方差分析表略）。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（表4）表明，正交分析得到最佳提取條件A3B3C3優(yōu)于正交組中含量最高組合A3B3C2。

表2 因素水平表Table 2 Factor level table

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Orthogonal experiment results

表4 提取條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 4 Verification test of extraction conditions（n＝2）mg/g

2.4 精密度試驗(yàn)

取同一份樣品溶液重復(fù)進(jìn)樣3次，記錄α－茄堿、α－卡茄堿面積，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知：同一樣品重復(fù)進(jìn)樣，RSD分別為1.13%，0.58%，說(shuō)明儀器精密度良好。

表5 精密度試驗(yàn)Table 5 Results of precision test

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份樣品溶液，分別于0，1，2，3，4h進(jìn)樣，記錄α－茄堿、α－卡茄堿峰面積，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知：樣品溶液在4h內(nèi)穩(wěn)定，RSD 分別為2.33%，2.94%。

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 6 Results of stability test

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取馬鈴薯皮樣品，按方法分別制得供試品溶液3份，分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄α－茄堿、α－卡茄堿峰面積，結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知：峰面積RSD 分別為3.11%，1.10%，方法重現(xiàn)性好。

表7 重復(fù)性試驗(yàn)Table 7 Results of repeated test

2.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密取已知含量的馬鈴薯皮原料3份各1.0g，精確加入α－茄堿標(biāo)準(zhǔn)品適量，按樣品制備方法提取并分析，結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知：α－茄堿的回收率在101.61%～97.44%，平均回收率為99.4%，RSD為1.1%，回收率高，達(dá)到測(cè)定要求。

表8 加標(biāo)回收率試驗(yàn)Table 8 Results of recovery test

2.8 樣品含量測(cè)定

按1.3.4方法制備馬鈴薯不同部位供試品溶液，平行制備2次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表9。由表9可知，馬鈴薯植物的不同部位均含有生物堿，且兩種生物堿含量差異很大，α－茄堿的含量為0.13～1.59mg/g，由高到低為薯皮＞葉＞地上全株≈薯肉＞莖；α－卡茄堿的含量為0.39～8.28mg/g，由高到低為葉＞薯皮＞地上全株＞薯肉＞莖；兩種生物堿總量為0.52～9.37mg/g，同一部位中α－卡茄堿的含量是α－茄堿含量的1.2～7.6倍。

3 結(jié)束語(yǔ)

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)提取條件的優(yōu)化、檢測(cè)方法學(xué)考察等試驗(yàn)建立了HPLC—ELSD測(cè)定馬鈴薯中兩種主要生物堿α－茄堿和α－卡茄堿的方法，樣品處理方法簡(jiǎn)便，不需凈化直接進(jìn)樣，目標(biāo)組分的色譜峰形好，柱效高，分離度好。同時(shí)試驗(yàn)基于ELSD檢測(cè)器對(duì)結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)具有相同響應(yīng)因子的特點(diǎn)，通過(guò)α－茄堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線完成α－茄堿和α－卡茄堿的含量測(cè)定，對(duì)一些標(biāo)準(zhǔn)品缺乏的物質(zhì)含量檢測(cè)具有一定的借鑒意義。

表9 馬鈴薯不同部位生物堿含量Table 9 Alkaloid content in different part of the potato plant（n＝2） mg/g

由試驗(yàn)結(jié)果可知，馬鈴薯植物的不同部位均含有生物堿，葉、薯皮、地上全株部分含量較高，特別是馬鈴薯地上部分的產(chǎn)量遠(yuǎn)大于馬鈴薯皮，因此以地上部分特別是葉作為原料進(jìn)行糖苷生物堿的提取，并開(kāi)發(fā)成為藥品、生物農(nóng)藥等具有廣闊的前景，也可為農(nóng)業(yè)資源廢棄物的深度開(kāi)發(fā)利用開(kāi)辟新的途徑。

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