李 波 ，游 浩 ，沈昆偉 ，周春雷 ，趙汝放

（1.四川省綿陽市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 綿陽 621000；2.重慶市合川區(qū)畜牧站，重慶 合川 401520；3.四川省綿陽市涪城區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 綿陽 621000；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，四川 溫江 611130）

兔球蟲病是由艾美耳屬的多種球蟲寄生于家兔肝膽管及腸上皮細(xì)胞內(nèi)引起的一種常見的寄生性、多發(fā)性原蟲病[1]，具有很高的發(fā)病率和死亡率，是養(yǎng)兔場及散養(yǎng)戶最常見的危害最大的流行性寄生蟲病之一[2]。目前對(duì)兔球蟲病的防治多以抗球蟲化學(xué)藥物為主[3]，如新潔爾滅、氯苯胍、10%福爾馬林、地克珠利、莫能菌素等[4]。雖然這些藥物在短期內(nèi)對(duì)球蟲病有一定的治療效果，但長期使用會(huì)使球蟲產(chǎn)生抗藥性，而患病耐過家兔的糞便也會(huì)污染環(huán)境，使得感染反復(fù)循環(huán)[5]。

與化學(xué)藥物的作用效果比較，中藥對(duì)兔球蟲病的治療就比較獨(dú)特。因?yàn)橹胁菟庨L期使用不會(huì)出現(xiàn)抗藥性，毒副作用較小，具有殺毒抑菌、促進(jìn)機(jī)體生長和提高機(jī)體免疫力的作用[6]。已有研究發(fā)現(xiàn)這些中草藥對(duì)兔球蟲卵囊的發(fā)育有影響：川楝子、魚腥草、皂角、大蒜、洋蔥、葫蘆茶、石榴皮、常山、穿心蓮、白頭翁、側(cè)柏葉、苦參、山楂、鵝膽子、甘草等。苦楝子為楝科植物楝樹的干燥成熟果實(shí)?？嚅优c川楝子為同科同屬不同種植物，兩種果實(shí)的性狀、成分、藥效略有不同，應(yīng)分別入藥，不宜混淆。據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》和《本草綱目》記載，苦楝子有驅(qū)蟲作用，其乙醇提取物的作用強(qiáng)，緩慢而持久。本試驗(yàn)研究了苦楝子提取物對(duì)兔球蟲卵囊的殺滅效果，為中藥治療兔球蟲病提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)中藥 苦楝子，由綿陽市涪城區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。

1.1.2 球蟲卵囊 兔球蟲卵囊從感染了球蟲病的家兔糞便中提取。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 3個(gè)月健康家兔，由綿陽市涪城區(qū)某公司提供。

1.1.4 試驗(yàn)試劑 苦楝子、乙醇、飽和食鹽水、重鉻酸鉀、次氯酸鉀。

1.1.5 所用儀器 顯微鏡、電熱恒溫培養(yǎng)箱、粉碎機(jī)、離心機(jī)、電子天平。

本次試驗(yàn)于2014年5月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)國家級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)苦楝水提取物的試驗(yàn)觀察 先在小平皿內(nèi)加入預(yù)先稀釋好的球蟲卵囊懸液4mL，再分別加入質(zhì)量濃度為 1、0.5、0.25 g/mL的苦楝水提取物4mL，另外加入4mL 2.5%重鉻酸鉀溶液作陰性對(duì)照和4mL次氯酸鉀作陽性對(duì)照。將每組混勻，于28～30℃下恒溫培養(yǎng)，第24、48h和72h時(shí)分別檢查計(jì)數(shù)每組的卵囊孢子化率。

1.2.2 中藥成分的提取 選取表面光滑、形狀規(guī)則的苦楝子作原料，用毛刷刷洗干凈，去蒂、籽和瓤，切成薄片，晾干，用烤箱烘干（80℃）至干透后，冷卻至室溫，用粉碎機(jī)粉粹，過篩制成20g的苦楝子粉。將苦楝子粉加純水適量（以水面浸沒苦楝子粉為宜），浸提2次：分別浸泡 12、24 h，沸水開 30 min后，放冷，過濾，合并濾液，然后水浴濃縮至中藥濃度為2g/mL[7]。

1.2.3 兔球蟲卵囊的收集 利用兔球蟲進(jìn)行培養(yǎng)，使其孢子化，然后將孢子化卵囊感染正常家兔，觀察家兔的生理變化，用飽和食鹽水漂浮法從家兔糞便中檢測是否含有球蟲。具體方法如下：

電子天平上稱取100g含有兔球蟲卵囊的新鮮兔糞于燒杯中，加入飽和食鹽水浸泡搗爛，用過濾網(wǎng)將糞便殘?jiān)鼮V去，濾液倒入離心管中，2500r/min離心7min，棄去上清液，保留沉淀物（卵囊）；再向離心管中加入飽和食鹽水，3500r/min離心20min，得沉淀物；將沉淀物置于適量的含2.5%重鉻酸鉀溶液的平皿內(nèi)，然后將其平均分成25份，分別倒入5個(gè)6孔細(xì)胞培養(yǎng)皿的孔內(nèi)，做好標(biāo)記。

1.2.4 不同濃度中藥提取液對(duì)兔球蟲卵囊孢子化率的影響 用2.5%重鉻酸鉀溶液將苦楝子中藥配制成1、0.5、0.25 g/mL的濃度梯度，同時(shí)以2.5%重鉻酸鉀溶液作陰性對(duì)照，次氯酸鉀作陽性對(duì)照。于上述1.2.3的細(xì)胞培養(yǎng)皿孔內(nèi)加入中藥及對(duì)照溶液（4 mL/孔），搖勻，然后放入27℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于0、24、48h及72h時(shí)進(jìn)行球蟲卵囊計(jì)數(shù)，并計(jì)算出每組的卵囊孢子化率。

1.3 數(shù)據(jù)處理采用麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)法計(jì)算出每克糞便中未孢子化和已孢子化的球蟲卵囊數(shù)個(gè)數(shù)（OPG）。

OPG=（A 片+B 片）÷2×100（國標(biāo)，2003）[8]

孢子化率（%）=孢子化卵囊/（孢子化卵囊+未孢子化卵囊）×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析運(yùn)用SPSS 20.0 for Windows軟件對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，觀察結(jié)果采用X±SD表示，用卡方檢驗(yàn)判斷差異的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 相同時(shí)間不同濃度的藥物對(duì)球蟲卵囊孢子化率的影響（見表1）在24h時(shí)，1g/mL的苦楝水提取物對(duì)兔球蟲卵囊孢子化的影響大于其他組，0.5g/mL和0.25g/mL苦楝水提取物的效果一樣，且大于陰性對(duì)照組；在48h時(shí)，1g/mL的苦楝水提取物對(duì)兔球蟲卵囊孢子化的影響大于其他組，0.5 g/mL的效果大于0.25g/mL和陰性對(duì)照組，0.25g/mL和陰性對(duì)照組的效果一樣；72h時(shí)的效果和48h的效果一樣。

表1 不同時(shí)間不同濃度藥物對(duì)兔球蟲卵囊孢子化率的影響結(jié)果（ΔX±SD）

2.2 相同濃度藥物在不同時(shí)間對(duì)球蟲卵囊孢子化率的影響從表1可見，在不同時(shí)間，1g/mL的苦楝水提取物對(duì)兔球蟲卵囊孢子化率的影響最大，效果好于陰性對(duì)照組，看圖1可以說明效果最好；0.5g/mL的苦楝水提取物對(duì)兔球蟲卵囊孢子化率的效果好于陰性對(duì)照組，看圖2可以說明效果一般；0.25g/mL的苦楝水提取物對(duì)兔球蟲卵囊孢子化率的影響最小，看圖3可以說明效果幾乎沒有。

圖1 1g/mL苦楝水提取物與對(duì)照組的對(duì)比

圖2 0.5g/mL苦楝水提取物與對(duì)照組的對(duì)比

圖3 0.25g/mL苦楝水提取物與對(duì)照組的對(duì)比

3 討論

球蟲卵囊經(jīng)病兔糞便排出后，需在外界適宜的環(huán)境中進(jìn)行孢子生殖，發(fā)育為孢子化卵囊后才具有致病性。所以球蟲卵囊體外孢子化率的高低直接影響球蟲卵囊的致病力。本病的傳染多數(shù)因家兔食入被球蟲卵囊污染的飼料或飲用水，或者家兔排出的糞便中帶有球蟲卵囊，對(duì)兔舍清掃消毒不徹底而致病[9]。兔球蟲病一年四季均可發(fā)生和流行，特別是在溫暖、雨水較多的春、夏季節(jié)，該病常呈地方性流行[10]。當(dāng)溫度在20～28℃范圍內(nèi)，相對(duì)濕度在55%～75%范圍內(nèi)，并且氧氣充足的時(shí)候，兔球蟲卵囊經(jīng)過2～3 d便可以發(fā)育成熟并且具有一定的感染力。

現(xiàn)階段，有人用苦楝子作為豬的驅(qū)蟲藥，并在用藥量方面作了探討?？嚅拥闹饕煞钟锌嚅?、揮發(fā)性脂肪酸、山茶酚、樹脂、鞣質(zhì)等?？嚅泳哂序?qū)豬蛔蟲的作用，豬對(duì)苦楝子的敏感性比其他動(dòng)物更強(qiáng)，但用苦楝子驅(qū)豬蛔蟲，易發(fā)生中毒，這主要是因?yàn)槲窗凑阵w重計(jì)算用藥量。試驗(yàn)表明，采用苦楝子驅(qū)豬蛔蟲的最適劑量為每千克體重6.0～11.79 g，有效率可達(dá)75%。還有人做了苦楝子對(duì)釘螺殺滅作用的研究，結(jié)果也證明苦楝子提取液對(duì)釘螺有較強(qiáng)的殺滅作用，且以70%乙醇提取的藥液的效果最好，其半數(shù)致死濃度只有381.2mg/L。

[1] 王璽德，盛書娟，祝建平，等.石榴皮提取物對(duì)離體培養(yǎng)兔球蟲卵囊的殺滅作用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（2）:212.

[2] 代德華，楊增岐.兔球蟲病流行特點(diǎn)及其防控[J].畜牧與飼料科學(xué)，2012，33（1）：96-97.

[3] 朱樓英，何忠平，余建國.兔球蟲病藥物防治的進(jìn)展[J].福建畜牧獸醫(yī)，2010，32（3）：35.

[4] 郭明生.不同化學(xué)藥物抑殺兔球蟲卵囊試驗(yàn)[J].中國養(yǎng)兔雜志，1994（4）：8-9.

[5] 郭莉，毛光瓊，陽愛國，等.兔球蟲病的危害及防治進(jìn)展[J].四川畜牧獸醫(yī)，2011，38（10）：29-30.

[6] 張國.中草藥對(duì)兔球蟲卵囊孢子化的影響[J].新疆畜牧業(yè)，2012（7）：16-18.

[7] 曾灶昌，鐘超.苦楝子中有效成分的提取分離及促進(jìn)膽固醇流出作用研究[J].中外醫(yī)療，2008（16）：12-13.

[8] 秦建華，李國清.動(dòng)物寄生蟲病學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2007.

[9] 賈路，王彥，石清來.球蟲病對(duì)兔的危害與防治[J].中國畜禽種業(yè)，2012（5）：114.

[10]方宗敏，兔球蟲病的發(fā)病機(jī)制、診斷和綜合防制[J].中國動(dòng)物檢疫，2012，9（7）：55.