楊 樹，趙曼曼，扈金萍，盛 莉

中國醫(yī)學科學院藥物研究所 創(chuàng)新藥物非臨床藥物代謝及藥代/藥效研究北京市重點實驗室，北京100055

雙環(huán)醇(百賽諾)是我國首個具有自主知識產權的治療慢性肝炎的化學藥。雙環(huán)醇還可預防和治療降脂藥［1-2］及腎移植術后抗排斥藥物引起的肝損傷［3］，此外，雙環(huán)醇與二甲雙胍的聯(lián)合應用可有效地改善合并空腹血糖調節(jié)受損(IFG)的非酒精性脂肪性肝病患者的肝功能異常及肝組織學病變［4］。應用雙環(huán)醇進行上述保肝抗炎治療是否會影響合用藥物的代謝，是臨床聯(lián)合用藥需要關注的重要問題。本研究選擇了4種臨床可能與雙環(huán)醇合用的藥物，旨在了解雙環(huán)醇對這些藥物體外代謝的影響，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)藥物和試劑:雙環(huán)醇(Bicyclol)、鹽酸二甲雙胍(Metforminhydrochloride)由北京協(xié)和藥廠提供，他克莫司(Tacrolimus)由華北制藥集團新藥研究開發(fā)中心提供，非諾貝特(Fenofibrate，批號為100733-200401)購自中國食品藥品檢定研究院，環(huán)孢素A(CAS:59865-13-3)購自Sigma 公司。甲醇、乙腈均為HPLC 級(美國Fisher 公司);(2)人肝微粒體購自上海瑞德肝臟疾病研究有限公司，產品編號LM-H-010M，批號FZTO;(3)實驗動物:雄性SD 大鼠，200 ～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。動物許可證編號:SCXK(京)2012-0001;(4)儀器與設備:GL-88B 漩渦混合器(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)，HZS-H水浴振蕩器(哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠制造)，AR1140/C 精密天平(美國OHAUS 公司)，Thermo Biofuge Prime R 低溫離心機(美國Thermo Scientific 公司)，20PR-52D 型低溫高速離心機(日本HITACHI 公司)，SCP7OH 型低溫超速離心機(日本HITACHI 公司)，液相色譜質譜聯(lián)用儀包括:Surveyor 色譜儀和TSQ Quantum Access 三重四級桿質譜儀(美國Thermo Scientific 公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝微粒體制備:大鼠禁食過夜后斷頭處死，迅速取出肝臟，用冷生理鹽水漂洗后稱重，加冰浴TMS(含 Tris 50 mmol/L，MgCl23 mmol/L，蔗 糖200 mmol/L，pH=7.4)緩沖液制成25%勻漿(W/V)，4 ℃離心10 000 g ×20 min。取上清液于4 ℃離心105 000 g×60 min，上清液為胞漿，沉淀即為微粒體。將沉淀按每克肝重加1 ml TMS 制成勻漿，分裝存于-80 ℃?zhèn)溆?。按照Lowery 法測定肝微粒體蛋白濃度，以差示分光光度法測定CYP450 酶含量。

1.2.2 大鼠和人肝微粒體體外溫孵條件:實驗分為對照組(無雙環(huán)醇組)、同時加藥組(雙環(huán)醇與受試藥物同時加入，預溫孵5 min 后加NADPH 啟動反應)及后加藥組(雙環(huán)醇在NADPH 存在的情況下溫孵10 min后再加入受試藥物)。溫孵體系中含大鼠肝微粒體蛋白(0.75 mg/ml)或人肝微粒體蛋白(1 mg/ml)、NADPH 發(fā)生系統(tǒng)和Tris-Hcl 緩沖液(50 mmol/L，pH =7.4)，反應總體積為200 μl。大鼠和人肝微粒體溫孵體系中各藥物濃度為雙環(huán)醇4 μg/ml，他克莫司分別為60 ng/ml 和900 ng/ml［5］，非諾貝特360 ng/ml，鹽酸二甲雙胍200 ng/ml，環(huán)孢素A 1 200 ng/ml［6-7］。溫孵時間:他克莫司與大鼠和人肝微粒體分別溫孵20 min、8 min，非諾貝特/二甲雙胍/環(huán)孢素A 與大鼠和人肝微粒體均溫孵30 min。測定他克莫司和二甲雙胍原型藥含量及環(huán)孢素A 和非諾貝特代謝產物含量。

1.2.3 標準曲線制備:(1)他克莫司:空白肝微粒體溫孵液(200 μl)中分別加入不同濃度他克莫司工作液(10、25、100、250 ng/ml、1、2.5、5 μg/ml)40 μl，再加入360 μl 乙腈，振蕩混勻，14 000 ×5 min 離心2 次，取上清液5 μl 進行LC/MS 分析。(2)二甲雙胍:空白肝微粒體溫孵液(200 μl)中分別加入不同濃度二甲雙胍工作液(25、100、250 ng/ml，1、2.5、4、5 μg/ml)40 μl，再加入360 μl 乙腈，振蕩混勻，14 000 ×5 min 離心2 次，取上清液5 μl 進行LC/MS 分析。(3)環(huán)孢素A:空白肝微粒體溫孵液(200 μl)中分別加入不同濃度環(huán)孢素A 工作液(50、250 ng/ml，1、2.5、5、6、8 μg/ml)40 μl，再加入360 μl 乙腈，振蕩混勻，14 000 ×5 min 離心2次，取上清液5 μl 進行LC/MS 分析。

1.2.4 LC-MS 檢測條件:(1)他克莫司:CAPCELL PAK色譜柱(2.1 mm ×100 mm，5 μm)，流動相為乙腈:10 mmol/L醋酸銨水溶液(95∶5)，流速為0.2 ml/min，SRM 檢測m/z 826.4→616.0。(2)二甲雙胍:CAPCELL PAK 色譜柱(2.1 mm×100 mm，5 μm)，流動相為乙腈:10 mmol/L 醋酸銨水溶液(75 ∶25)，流速為0.3 ml/min，SRM 檢測m/z 130 →71. 2。(3)環(huán)孢素A:CAPCELL PAK 色譜柱(2.1 mm×100 mm，5 μm)，流動相為甲醇:10 mmol/L 醋酸銨水溶液(97∶3)，流速為0.3 ml/min，SRM 檢測m/z 1202.8→425.1(環(huán)孢素A);m/z 1218.8→425.1(環(huán)孢素A 單加氧化代謝產物)。(4)非諾貝特酸:Zorbax SB-C18 色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)，流動相為甲醇:10 mmol/L 醋酸銨水溶液(90∶10，含0.1%甲酸)，流速0.2 ml/min，SRM 檢測m/z 319.1→232.9。

1.3 統(tǒng)計學處理 將加藥溫孵組與加藥0 時組比較，計算原型藥代謝速率或代謝產物生成速率。由下列公式計算雙環(huán)醇對合用藥物體外代謝抑制率:抑制率(%)=(對照組代謝速率-加藥組代謝速率)/對照組代謝速率×100%。組間原型藥含量或代謝產物含量采用Student’s test 分析，P ＜0. 05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝微粒體溫孵液中藥物標準曲線 肝微粒體溫孵液中各藥物峰面積和濃度線性關系良好，相關系數(shù)為0.9907 ～0.9987(見圖1 ～2)。

2.2 雙環(huán)醇對二甲雙胍、非諾貝特、環(huán)孢素A、他克莫司在大鼠肝微粒體中代謝的影響 他克莫司(60 ng/ml)與大鼠肝微粒體(0. 75 mg/ml)溫孵20 min 后減少77.5%，代謝速率為3.58 pmol·min-1·mg-1)。雙環(huán)醇(10 μmol/L)與他克莫司同時和預先溫孵后，他克莫司含量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，提示雙環(huán)醇對他克莫司在大鼠肝微粒體中的代謝無明顯影響。二甲雙胍(200 ng/ml)與大鼠肝微粒體溫孵30 min 含量無明顯減少，提示二甲雙胍在大鼠肝微粒體中穩(wěn)定。雙環(huán)醇同時和預溫孵對二甲雙胍在大鼠肝微粒體中的穩(wěn)定性無明顯影響(見表3)。如表4 所示，非諾貝特(360 ng/ml)與大鼠肝微粒體溫孵30 min 后可檢測到代謝產物非諾貝特酸，雙環(huán)醇同時和預溫孵組非諾貝特酸生成量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，提示雙環(huán)醇對非諾貝特在大鼠肝微粒體中的代謝無明顯影響。環(huán)孢素A(1 200 ng/ml)與大鼠肝微粒體溫孵30 min 后可檢測到環(huán)孢素A 單加氧代謝物，雙環(huán)醇同時和預溫孵組環(huán)孢素A 單加氧代謝物生成量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，提示雙環(huán)醇對環(huán)孢素A 在大鼠肝微粒體中的代謝無明顯影響(見表5)。

圖1 大鼠肝微粒體溫孵液中他克莫司(A)和二甲雙胍(B)標準曲線Fig 1 Calibration curve of Tacrolimus and Metformin in rat liver microsomes

圖2 人肝微粒體溫孵液中他克莫司(A)、二甲雙胍(B)和環(huán)孢素A(C)標準曲線Fig 2 Calibration curve of Tacrolimus，Metformin and Cyclosporine A in human liver microsomes

表3 雙環(huán)醇對他克莫司和二甲雙胍在大鼠肝微粒體中代謝的影響Tab 3 Effect of Bicyclol on tacrolimus and Metformin metabolism in rat liver microsomes

2.3 雙環(huán)醇對二甲雙胍、非諾貝特、環(huán)孢素A、他克莫司在人肝微粒體中代謝的影響 他克莫司(900 ng/ml)與人肝微粒體溫孵8 min 后減少64. 4%，雙環(huán)醇(10 μmol/L)同時和預溫孵組他克莫司剩余含量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0. 05);環(huán)孢素A(1 200 ng/ml)與人肝微粒體溫孵30 min 后剩余66.7%，雙環(huán)醇同時和預溫孵組對環(huán)孢素A 剩余量無明顯影響。此外，雙環(huán)醇同時和預溫孵組二甲雙胍含量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，提示雙環(huán)醇對他克莫司、環(huán)孢素A 和二甲雙胍在人肝微粒體中的代謝均無明顯影響(見表6)。非諾貝特(360 ng/ml)與人肝微粒體溫孵30 min 可以檢測到代謝產物非諾貝特酸，雙環(huán)醇同時和預溫孵組非諾貝特酸生成量與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，提示雙環(huán)醇對非諾貝特在人肝微粒體中的代謝也無明顯影響(見表7)。

表4 雙環(huán)醇對非諾貝特在大鼠肝微粒體中代謝的影響Tab 4 Effect of Bicyclol on Fenofibrate metabolism in rat liver microsomes

表5 雙環(huán)醇對環(huán)孢素A 在大鼠肝微粒體中代謝的影響Tab 5 Effect of Bicyclol on Cyclosporine A metabolism in rat liver microsomes

表6 雙環(huán)醇對他克莫司、環(huán)孢素A 和二甲雙胍在人肝微粒體中代謝的影響Tab 6 Effect of Bicyclol on Tacrolimus，Cyclosporine A and Metformin metabolism in human liver microsomes

注:與對照組(無雙環(huán)醇組)比較，* P ＞0.05。

表7 雙環(huán)醇對非諾貝特在人肝微粒體中代謝的影響Tab 7 Effect of Bicyclol on Fenofibrate metabolism in human liver microsomes

3 討論

以往研究顯示，雙環(huán)醇主要經大鼠和人肝微粒體CYP3A 代謝［8］，對CYP3A 無明顯抑制作用，僅有輕微的誘導作用，對其自身代謝無影響。二甲雙胍是目前應用最為廣泛的抗糖尿病藥物［9］。二甲雙胍主要經腎臟排泄，在肝內不代謝。環(huán)孢素A 和他克莫司均為強效免疫抑制劑，其中他克莫司具有急性排斥反應發(fā)生率和嚴重程度較低的特點［10］，已逐漸取代環(huán)孢素A成為器官移植術后的首選藥物。非諾貝特為第二代苯氧芳酸類降血脂藥，用于治療成人飲食控制療法效果不理想的高脂血癥。已知環(huán)孢素A、他克莫司、非諾貝特都是通過CYP3A 代謝［11］的臨床藥物，因此，本研究選擇上述臨床常用且主要經CYP3A 代謝的藥物觀察雙環(huán)醇對上述藥物體外代謝的影響。

研究結果表明，他克莫司與大鼠和人肝微粒體溫孵分別減少77.5%、64.4%，環(huán)孢素A 和非諾貝特溫孵后檢測到代謝產物生成，提示本研究使用的體外代謝溫孵體系可靠。二甲雙胍與大鼠和人肝微粒體溫孵30 min 無明顯減少，提示二甲雙胍不經肝臟CYP450代謝。在大鼠肝微粒體溫孵體系中，雙環(huán)醇(10 μmol/L)同時加入和預溫孵后對環(huán)孢素A 和非諾貝特代謝產物生成的抑制率均＜10%，對他克莫司代謝及二甲雙胍含量也無明顯影響。在人肝微粒體溫孵體系中，雙環(huán)醇(10 μmol/L)同時加入和預溫孵后對他克莫司和環(huán)孢素A 代謝的抑制率均＜10%，對非諾貝特酸的生成及二甲雙胍含量均無明顯影響。

本研究選擇的雙環(huán)醇濃度明顯高于臨床最高血藥濃度［12］，各受試臨床合用藥物濃度均在臨床可達到的血藥濃度范圍內，因此推測雙環(huán)醇對臨床合用藥藥物代謝影響的可能性較小。鑒于聯(lián)合用藥后藥物在體內吸收、分布、代謝、排泄等過程較為復雜，且存在個體差異，因此，雙環(huán)醇對人體內臨床聯(lián)合用藥的影響程度有待進一步研究。

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