李春梅，張 林，侯艷紅，李 楠

1.解放軍第309 醫(yī)院消化科，北京100091;2.河北北方學(xué)院

α-氰基丙烯酸正丁酯(butylcyanoacrylate，BCA)早期主要用做醫(yī)用膠、組織粘合劑、醫(yī)用材料等，具有組織、血液、免疫等生物兼容性。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)利用聚合反應(yīng)制備的聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒子(polybutylcyanoacrylate nanoparticles，PBCA-NPs)可吸附、包裹藥物，不但對(duì)藥物有靶向傳輸功能，還能起到緩釋作用，從而提高藥物的療效并減少對(duì)機(jī)體的毒副作用，因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有更為廣泛的應(yīng)用前景。前期國(guó)內(nèi)已有學(xué)者對(duì)PBCA-NPs 在生物體內(nèi)的分布情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)靜脈用藥后主要分布于肝、肺、脾等組織［1-2］。大多學(xué)者［3-4］通過(guò)檢測(cè)藥物在各組織中的濃度來(lái)確定載藥納米粒子的組織分布情況，最近，部分研究者［5-7］通過(guò)活體成像的方法觀察納米粒子在體內(nèi)代謝。而不同粒徑PBCA-NPs 對(duì)器官組織分布情況的影響及在組織中代謝速度的研究相對(duì)匱乏。以上情況均提示本研究的必要性和可行性。

吲哚菁綠(indocyanine green，ICG)是目前被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)的用于醫(yī)療臨床使用的花青染料，廣泛應(yīng)用于光動(dòng)力治療［8］、生物醫(yī)學(xué)成像［9］、腫瘤檢測(cè)［10］及腦血管毒性評(píng)價(jià)［11］等方面。本研究中利用ICG 在近紅外光譜范圍內(nèi)的較強(qiáng)吸收和熒光特性將其包埋于PBCA-NPs，從而實(shí)現(xiàn)納米粒子生物體內(nèi)的顯像示蹤，并成功制備出不同納米粒徑的ICG-PBCA-NPs，就PBCA-NPs 納米粒徑對(duì)于其生物體內(nèi)組織中的分布及代謝影響進(jìn)行研究。從而為納米粒子靶向運(yùn)輸?shù)呐R床應(yīng)用提供有效支持。

1 材料與方法

1.1 材料 α-氰基丙烯酸正丁酯(BCA，北京瞬康醫(yī)用膠有限公司);吲哚菁綠(ICG，上海晶純生化科技股份有限公司);Dextran70(德國(guó)BASF 公司);ICG-PBCA-NPs(自制，含量:0.5 mg/ml);抗熒光淬滅封片液(P0126，碧云天生物技術(shù)研究所);其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)儀器包括85-2 恒溫加熱磁力攪拌器(上海志威電器有限公司);微孔濾膜(欣惠澤奧有限公司)，IX71 熒光顯微鏡(日本Olympus 公司);RF-5301PC 熒光分光光度計(jì)(日本島津公司)。健康雄性昆明小鼠體質(zhì)量(28 ±3)g，由中國(guó)人民解放軍309 醫(yī)院結(jié)核研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 ICG-PBCA-NPs 的制備:通過(guò)控制乳化聚合過(guò)程中的溫度、pH 值、攪拌速度、穩(wěn)定劑及原料的用量等條件制備粒徑為20、50、100、150、200 nm 左右的ICGPBCA-NPs。取BCA 適量溶解于丙酮中作為有機(jī)相(溶液Ⅱ);將Dextran70 及ICG 用蒸餾水溶解后作為水相(溶液Ⅰ)，并用0.1 mol/L 的HCl 調(diào)pH 值。室溫條件下一定轉(zhuǎn)速磁力攪拌，按一定比例將有機(jī)相緩緩加入水相中，繼續(xù)磁力攪拌3 h 至有機(jī)溶劑揮盡，用0.1 mol/L NaOH 水溶液調(diào)節(jié)體系的pH=7.0，繼續(xù)攪拌0.5 h，利用微孔濾膜過(guò)濾溶液后低溫靜置，即可得到乳白色I(xiàn)CG-PBCA-NPs 微球膠體溶液。

1.2.2 ICG 于各組織中濃度測(cè)量:ICG 2 mg 溶于0.1 mol/L PBS 2 ml 中配成1 000 μg/ml ICG 標(biāo)準(zhǔn)原液，以PBS為溶劑配制ICG 梯度稀釋液，選擇805 nm 波長(zhǎng)進(jìn)行熒光定量實(shí)驗(yàn)，以ICG 濃度為橫坐標(biāo)，A 值為縱坐標(biāo)，繪制ICG 溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。取昆明種小鼠隨機(jī)分為6組:(25.0 ±7. 6)nm ICG-PBCA-NPs 組(第1 組);(49.0 ±8.6)nm ICG-PBCA-NPs 組(第2 組);(88.0 ±20.5)nm ICG-PBCA-NPs 組(第3 組);(145.0 ±13.5)nm ICG-PBCA-NPs 組(第4 組);(205. 0 ± 8. 4)nm ICG-PBCA-NPs 組(第5 組);空白對(duì)照組(第6 組)。1 ～5 組每只小鼠分別注射ICG-PBCA-NPs 溶液(10 mg/kg)，空白組注射等量生理鹽水，均經(jīng)尾靜脈注射。分別于注射0.5、1、5、12 h 后行頸椎脫臼各處死3 只小鼠，取心、肝、脾、腎、胰等臟器，于組織勻漿器制成組織勻漿，4 ℃過(guò)夜，離心(8 000 r/min，10 min，離心半徑10 cm)，應(yīng)用熒光分光光度計(jì)測(cè)定ICG 的A 值，根據(jù)ICG 溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各臟器中含ICG 的量。將每組3 只平行動(dòng)物所對(duì)應(yīng)的ICG 的量取均值。1.2.3 熒光納米粒子于小鼠體內(nèi)的熒光顯像:將以上每組分別于注射0.5、1、5、12 h 后分離得到的心、肝、脾、腎、胰用生理鹽水洗凈后用濾紙吸干多余水分，各組織切成1 cm×1 cm×0.3 cm 大小的組織塊，迅速放入液氮中冷凍保存。將冰凍組織裝于切片機(jī)固定器上夾緊進(jìn)行切片，將組織切片貼于載玻片用P0126 封片，置于倒置熒光顯微鏡下觀察組織熒光微球分布情況，并拍照記錄。

2 結(jié)果

2.1 乳化聚合法合成熒光納米粒子 通過(guò)乳化聚合法在去離子水中制備ICG-PBCA-NPs。調(diào)控制作過(guò)程中pH 值、攪拌速度、Dextran70 質(zhì)量濃度、α-氰基丙烯酸正丁酯質(zhì)量濃度，成功制得(25.0 ±7.6)nm、(49.0 ±8.6)nm、(88.0±20.5)nm、(145.0±13.5)nm、(205.0±8.4)nm 5 種粒徑ICG-PBCA-NPs。避光室溫條件下保存2 ～3個(gè)月，用蒸餾水溶解后可見(jiàn)納米粒子具有較好的分散性，其形態(tài)、大小基本沒(méi)有變化。

2.2 熒光納米粒子在小鼠體內(nèi)的分布及代謝

2.2.1 ICG 于各組織中濃度測(cè)量:ICG 溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y =1.0365x +0.7219，R2= 0.9957(x 代表ICG 濃度，y 代表吸光度，R 為精確度)。根據(jù)各組織中ICG 的A 值計(jì)算出組織中ICG 的量。第6 組于波長(zhǎng)805 nm 下測(cè)量的各臟器熒光強(qiáng)度結(jié)果均非常弱，因此暫將其對(duì)ICG 的熒光結(jié)果造成的干擾忽略。(25.0 ±7.6)nm ICG-PBCA-NPs組于小鼠各組織器官中均未見(jiàn)明顯分布。肝、脾是ICG-PBCA-NPs 的主要聚集臟器，肝臟、脾臟于納米粒徑為(145.0 ±13.5)nm 時(shí)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，但隨著ICGPBCA-NPs 納米粒徑的減小，其于肝、脾中的熒光強(qiáng)度減弱。隨著納米粒子粒徑的減少，在腎臟熒光強(qiáng)度略有增強(qiáng)，但變化不明顯。心臟于各納米粒徑各時(shí)間點(diǎn)ICG-PBCA-NPs 分布均較少或無(wú)。胰腺組織中熒光濃度隨著納米粒子粒徑的減小逐漸增強(qiáng)，于(49. 0 ±8.6)nm 組注射1 h 出現(xiàn)最高濃度，并且各時(shí)段胰腺組織熒光強(qiáng)度于(49.0 ±8.6)nm 粒子組明顯強(qiáng)于(88.0±20.5)nm、(145.0 ±13.5)nm、(205.0 ±8.4)nm 組。心、肝、脾、腎、胰腺于各組出現(xiàn)的最強(qiáng)熒光濃度繪制成折線圖，如圖2 所示。

圖1 ICG 濃度與A 值的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 The standard curve of ICG concentration and A value

圖2 小鼠各臟器在不同粒徑下的最強(qiáng)濃度曲線Fig 2 The strongest fluorescence distribution of different diameter nanoparticles in mice

2.2.2 熒光納米粒子于小鼠體內(nèi)的熒光顯像:分別于0.5、1、5、12 h 將各組小鼠解剖，采集心、肝、脾、腎、胰等器官組織制作冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。其結(jié)果與ICG 于各組織中濃度測(cè)量結(jié)果基本吻合。熒光顯微鏡下獲得的心、肝、脾、腎、胰所對(duì)應(yīng)的最強(qiáng)熒光如圖3 所示。

圖3 熒光顯微鏡下心、肝、脾、腎、胰最強(qiáng)熒光圖(400 ×) A:心臟最強(qiáng)熒光圖;B:肝臟最強(qiáng)熒光圖;C:脾臟最強(qiáng)熒光圖;D:腎臟最強(qiáng)熒光圖;E:胰腺最強(qiáng)熒光圖Fig 3 The strongest fluorescences of heart，liver，spleen，kidney and pancreas under the fluorescencemicroscope (400 ×) A:the strongest fluorescence in heart;B:the strongest fluorescence in liver;C:the strongest fluorescence in spleen;D:the strongestfluorescence in kidney;E:the strongest fluorescence in pancreas

3 討論

聚氰基丙烯酸正丁酯是一種無(wú)毒、分子量小、生物相容性較好、可生物降解的高分子納米材料。本實(shí)驗(yàn)采用氰基丙烯酸正丁酯為聚合單體，通過(guò)乳化聚合法制備可生物降解的PBCA-NPs，并將ICG 包載其中達(dá)到成功熒光顯像作用。鑒于水中OH-可引發(fā)BCA 單體之間發(fā)生親核反應(yīng)而聚合，因此，通過(guò)調(diào)節(jié)pH 值可以調(diào)控氰基丙烯酸酯的聚合，另外制作過(guò)程中攪拌速度、相關(guān)原料比例的改變均會(huì)影響聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒子的外觀形態(tài)、粒徑大小、分散性等。我們?cè)谥谱鬟^(guò)程中通過(guò)調(diào)控pH 值、攪拌速度、相關(guān)原料比例、穩(wěn)定劑類型成功制備出不同粒徑ICG-PBCA-NPs，其中粒徑最小的納米粒子是(25.0 ±7.6)nm。最終將不同粒徑的納米粒子按照分組通過(guò)尾靜脈注射于小鼠體內(nèi)，在不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，解剖小鼠取其心、肝、脾、腎、胰腺組織各臟器于組織勻漿器中制成組織勻漿，離心后利用分光光度計(jì)測(cè)定各組織中熒光強(qiáng)度;同時(shí)于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)將各臟器制作冰凍切片并獲得熒光圖片，觀察不同粒徑ICG-PBCA-NPs 于不同時(shí)間點(diǎn)在小鼠體內(nèi)各重要臟器代謝過(guò)程。將直觀觀察和熒光強(qiáng)度量化結(jié)合起來(lái)綜合評(píng)估不同粒徑PBCA-NPs 在各組織中的分布情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同粒徑納米粒子在不同組織分布明顯不同，大粒徑主要于肝、脾組織聚集，隨著粒徑減小，納米粒子體內(nèi)重新分布，在肝、脾分布減少，而胰腺、腎臟的分布略增多，心臟分布增加不明顯。肝臟、脾臟最具靶向性的納米粒徑為(145.0 ±13.5)nm，因其較其他各組在肝臟組織的熒光強(qiáng)度均強(qiáng)。這與粒徑為100 ～200 nm 時(shí)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的巨噬細(xì)胞內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)至Kupffer 細(xì)胞，從而在肝、脾等部位明顯聚集的研究結(jié)果相吻合［1］。而胰腺中(49.0 ±8.6)nm組其熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其他粒徑在胰腺中的分布，說(shuō)明(49.0 ±8.6)nm 可能是胰腺最適粒徑大小。這可能與＜100 nm 的粒子可逃脫RES 的識(shí)別，在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)重新分布，且粒徑＜50 nm 時(shí)納米?？梢源┻^(guò)肝臟，從而使得PBCA-NPs 于其他器官組織中分布增多有關(guān)［12］。(25.0 ±7.6)nm 組在各組織中的熒光強(qiáng)度均較弱或幾乎沒(méi)有，這可能是因?yàn)榧{米粒子粒徑越小網(wǎng)狀內(nèi)皮吞噬系統(tǒng)越難識(shí)別，同時(shí)由于粒徑太小易透過(guò)腎小球基膜而使藥物過(guò)快地清除，而有相關(guān)報(bào)道認(rèn)為＜(48. 0 ±9. 2)nm 組的微?？蛇M(jìn)入骨髓，且粒徑越小越容易進(jìn)入骨髓［13］，還需我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。納米粒徑的大小不但影響ICGPBCA-NPs 在小鼠體內(nèi)的分布，還影響其代謝時(shí)間。肝臟、脾臟于(49.0 ±8.6)nm 組最強(qiáng)熒光發(fā)生的時(shí)間(1 h)明顯早于(88.0 ±20.5)nm、(145.0 ±13.5)nm 組、(205.0 ±8.4)nm 組(5 h)，說(shuō)明隨著納米粒子減小，其在小鼠體內(nèi)停留時(shí)間相對(duì)縮短。以上研究結(jié)果與我國(guó)學(xué)者申方良等［2］的研究結(jié)果基本吻合。他們就阿霉素聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒粒徑與肝靶向性的關(guān)系進(jìn)行研究，應(yīng)用高效液相色譜法測(cè)定納米粒子粒徑大小對(duì)小鼠體內(nèi)肝、脾、心、肺、腎組織、血漿內(nèi)阿霉素濃度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同粒徑在以上組織均有分布。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不但呼應(yīng)于以上研究，還檢測(cè)了該粒子是否能分布于胰腺組織。對(duì)于納米粒子用于胰腺癌的藥物治療有重要意義。

然而本研究尚有明顯不足，如在樣本量選擇上相對(duì)較少，增加樣本量后實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)更具說(shuō)服力。另外，時(shí)間點(diǎn)的選取、粒徑分布的細(xì)化、組織類型的增加均有利于實(shí)驗(yàn)的完善，以上均是我們接下來(lái)的研究工作中需要解決的問(wèn)題。Patra 等［14］將表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)標(biāo)記于載藥納米粒子表面，通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其靶向治療胰腺癌作用。Valetti 等［15］將CKAAKN 肽與載吉西他濱納米粒子相結(jié)合，利用CKAAKN 肽胰腺癌高識(shí)別性，從而對(duì)胰腺癌起到靶向治療作用。在以上研究基礎(chǔ)上，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)得出的胰腺組織的最適納米粒徑為(49.0 ±8.6)nm，設(shè)想將具有胰腺癌靶向標(biāo)志物標(biāo)記于最適粒徑PBCA-NPs 納米粒子表面，利用其對(duì)胰腺癌的特異性識(shí)別作用增強(qiáng)其與胰腺組織特異性識(shí)別，在此雙重作用下實(shí)現(xiàn)胰腺相關(guān)疾病特異無(wú)毒高效治療作用，將是一個(gè)有前途的研究方向。

綜上所述，利用不同粒徑PBCA-NPs 的組織分布及代謝特征，結(jié)合其可生物降解性及生物相容性高等特點(diǎn)，將其應(yīng)用于臨床研究治療將對(duì)未來(lái)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步產(chǎn)生巨大影響。

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