孟 瑩，朱圣韜，李 鵬，張澍田

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院消化科，國家消化系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京市消化疾病中心，消化疾病癌前病變北京市重點實驗室，北京100050

分泌型卷曲蛋白家族(secreted frizzled-related proteins，SFRPs)是Wnt 信號途徑的調(diào)節(jié)劑，可通過競爭性抑制Frizzled 受體而抑制Wnt 的活動，參與多種腫瘤的發(fā)生。近年來，多個研究發(fā)現(xiàn)SFRP1 基因啟動子區(qū)高甲基化導(dǎo)致的基因沉默可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)［1-3］。本研究目的是觀察SFRP1 基因表達及啟動子區(qū)甲基化在食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)中的表達情況，探討DAC 及TSA 對SFRP1 基因表達的影響，從而進一步明確SFRP1 基因在ESCC 發(fā)病機制中的作用，為ESCC 的診治提供新的可能的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1. 1 細胞:人類ESCC 細胞株EC109、EC9706、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13 由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所惠贈。Heec購自Sciencell(美國)，Het-1A 細胞購自ATCC(美國)。1.1.2 主要試劑和藥品:5-氮雜脫氧胞苷(DAC)和曲古抑菌素(TSA)購自Sigma 公司;Anti-acetyl-Histone H3 和H4 購自Millipore 公司;染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒購自Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):EC109、EC9706、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13 細胞株經(jīng)復(fù)蘇后于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)并傳代。Heec、Het-1A 復(fù)蘇后于各自專用培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測SFRP1 mRNA 表達:按TRIzol 試劑說明書提取各細胞系總RNA，并按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35 個循環(huán)，72℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，GAPDH 作為內(nèi)參照，其引物及退火溫度見表1。

表1 引物序列表Tab 1 Sequences for primers used in this study

1.2.3 DNA 提取及亞硫酸鹽修飾:使用細胞基因組DNA 提取試劑盒(TIANGEN DP208，中國)，按說明書進行。亞硫酸鹽修飾采用CpGenome DNA 修飾試劑盒(Chemicon，CA，USA)，按說明書進行。修飾好的DNA 用于進一步的測序和MSP 分析。

1.2.4 甲基化分析:甲基化特異性PCR 方法(methylation-specific PCR，MSP)分析組織SFRP1 基因甲基化狀態(tài)。引物序列見表1，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)條件95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35 個循環(huán)，最后72 ℃延伸7 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察PCR 產(chǎn)物條帶的位置。

1.2.5 DAC 及TSA 處理EC9706 細胞:EC9706 細胞株保存于液氮中，臨用前取出復(fù)蘇，含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基，按常規(guī)方法置于37℃、5% CO2混合氣體恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。細胞每1 ～2 d 換液一次。每2 ～3 d 以0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶4傳代，接種在新培養(yǎng)瓶內(nèi)。

單獨給藥時，將EC9706 細胞株分別與去甲基化制劑DAC 10 μmol/L 及組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 共同孵育24 h 和72 h。DAC、TSA 聯(lián)合應(yīng)用時，則將DAC 10 μmol/L 與EC9706 細胞株共同孵育72 h 后加用TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L與EC9706 細胞株共同孵育24 h。各濃度藥物處理細胞后，每24 h 更換含藥物的培養(yǎng)液一次。用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況及形態(tài)學(xué)變化，并且提取細胞總RNA 及用RT-PCR 方法檢測SFRP1 mRNA 表達恢復(fù)情況。

1.2.6 染色質(zhì)免疫共沉淀方法檢測EC9706 細胞組蛋白乙?；闆r:采用ChIP 試劑盒進行檢測，按說明書進行。計數(shù)大約3 ×106EC9706 細胞，甲醛交聯(lián)組蛋白和DNA，超聲破碎細胞和剪切DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定超聲破碎效果。加入乙?；M蛋白H3 抗體或乙?；M蛋白H4 抗體沉淀，收集抗體綁定的組蛋白-DNA 復(fù)合物，逆轉(zhuǎn)組蛋白-DNA 交聯(lián)，用蛋白酶K 處理和純化DNA，設(shè)計SFRP1 啟動子區(qū)域的引物，引物序列見表1，PCR 方法鑒定已純化的DNA，并用2%瓊脂糖凝膠電泳，回收瓊脂糖凝膠PCR 產(chǎn)物，連接T 載體，進行產(chǎn)物轉(zhuǎn)化及藍白斑篩選，鑒定陽性重組子和測序確認。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行分析。計數(shù)資料用s 描述，兩組間變量比較采用t 檢驗。率的比較采用χ2檢驗。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC 細胞系及永生化食管上皮細胞系中SFRP1 mRNA 的表達 EC109、EC9706、KYSE30、KYSE70、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13細胞株中均未見SFRP1 mRNA 表達，而Het-1A、Heec中可見其表達(見圖1)。

2.2 ESCC 細胞株及永生化食管上皮細胞株中SFRP1 基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài) MSP 方法檢測ESCC細胞株及永生化食管上皮細胞株中SFRP1 基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)(見圖2)。EC109、EC9706、KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE510、TE-1、TE-13均只見M 條帶、U 條帶未見;Het-1A、Heec U 條帶亮，M 條帶隱約可見;KYSE70 均可見U 和M 條帶。

圖1 ESCC 各細胞系及永生化食管上皮細胞系中SFRP1 基因的RT-PCR 電泳圖Fig 1 Expression of the SFRP1 gene in ESCC cell lines，with GAPDH as a control

圖2 MSP 方法示ESCC 各細胞株及永生化食管上皮細胞株中SFRP1 基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)凝膠電泳圖 U:非甲基化條帶;M:甲基化條帶Fig 2 Promoter hypermethylation of SFRP1 gene was shown in ESCC cell lines and two immortalized human esophageal epithelial cell lines (Het-1A and Heec) U:unmethylated;M:methylated

2.3 DAC 和TSA 干預(yù)對ESCC 細胞的影響 根據(jù)各株細胞SFRP1 表達水平及啟動子區(qū)甲基化水平差異，選擇高甲基化同時SFRP1 mRNA 無表達的EC9706 細胞株作為進一步研究對象。去甲基化制劑DAC 10 μmol/L 或組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 分別單獨與EC9706 細胞株共同孵育72 h 和24 h 后，用RT-PCR 檢測細胞株中SFRP1 mRNA 表達恢復(fù)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EC9706 細胞株SFRP1 mRNA 無明顯變化(見圖3A)。DAC 10 μmol/L 和TSA 聯(lián)合應(yīng)用，即DAC 10 μmol/L 與EC9706 細胞株共同孵育72 h 后加用TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 與EC9706 細胞株共同孵育24 h，再次檢測細胞株中SFRP1 mRNA 表達恢復(fù)情況，結(jié)果可見EC9706 細胞株SFRP1 mRNA 恢復(fù)表達(見圖3B)。

2.4 EC9706 細胞株中SFRP1 基因啟動子區(qū)組蛋白乙酰化狀態(tài) 采用染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)分析EC9706 細胞株中SFRP1 基因啟動子區(qū)域組蛋白乙?；癄顟B(tài)。分別用乙?；M蛋白H3 抗體、乙?；M蛋白H4 抗體沉淀DNA 作為模板進行PCR，兔IgG 作為陰性對照，每次實驗均帶有內(nèi)對照(Input)。PCR 鑒定結(jié)果進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4 所示。PCR 產(chǎn)物回收后進行連接測序，結(jié)果符合SFRP1 基因啟動子區(qū)序列。

圖3 DAC 和TSA 干預(yù)對EC9706 細胞株中SFRP1 mRNA表達影響的RT-PCR A:DAC 和TSA 單獨干預(yù)EC9706 細胞株中后，未見EC9706 細胞株SFRP1 mRNA 表達恢復(fù);GAPDH:內(nèi)參照;B:DAC 10 μmol/L 與TSA 0.3 μmol/L、1 μmol/L 聯(lián)合干預(yù)后，可見EC9706 細胞株SFRP1 mRNA 表達恢復(fù)Fig 3 Re-expression of SFRP1 mRNA in EC9706 after treatment with DAC and/or TSA by RT-PCR A:EC9706 cells were treated with DAC and TSA alone，with GAPDH as a control;B:EC9706 cells were treated with DAC and TSA together

圖4 EC9706 細胞株中SFRP1 基因啟動子區(qū)域組蛋白H3、H4 乙酰化狀態(tài)ChIP 結(jié)果 H3Ac、H4Ac:實驗對象;NAC:陰性對照;IN:內(nèi)對照Fig 4 Histone modification analysis at CpG islands of the SFRP1 promoter region by ChIP assay H3Ac，H4Ac:experimental object;NAC:negative control;IN:internal control

3 討論

SFRP1 基因位于染色體8p12-11.1，該位點在多種腫瘤中缺失，被認為可能是一個抑癌基因［4-5］。抑癌基因表達沉默是腫瘤發(fā)生過程中一個重要的發(fā)病機制，而DNA 甲基化是抑癌基因表達沉默的重要途徑。Suzuki 等［2-3］研究認為啟動子區(qū)高甲基化所介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄沉默是結(jié)直腸癌SFRP1 水平降低的主要機制;乳腺癌中也可見類似的研究結(jié)果。

本研究中我們發(fā)現(xiàn)SFRP1 基因作為一個可能的抑癌基因，在ESCC 細胞株中完全不表達，而在永生化食管上皮細胞中可以檢測到該基因的明顯表達，表明該基因存在轉(zhuǎn)錄水平表達改變，提示SFRP1 基因可能作為一個抑癌基因，在ESCC 發(fā)病機制中發(fā)揮一定作用。同時，MSP 研究發(fā)現(xiàn)，ESCC 腫瘤細胞系中存在SFRP1 基因啟動子區(qū)高甲基化，而在永生化人類食管上皮細胞系中甲基化程度極低。提示啟動子區(qū)甲基化可能與ESCC 中SFRP1 基因的表達異常相關(guān)。Ishii等［6］研究發(fā)現(xiàn)SFRP1 在ESCC、上皮內(nèi)瘤變及正常組織中均存在啟動子區(qū)高甲基化，甲基化程度呈逐漸降低趨勢，這和我們的研究結(jié)果相一致。

研究表明DNA 高甲基化可被許多因素調(diào)控，去甲基化制劑是最常見的一種干預(yù)手段，可使部分表達沉默的抑癌基因表達恢復(fù)。5 氮雜脫氧胞苷是有效的甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑，能時間和劑量依賴性地引起CpG 島過甲基化的抑癌基因去甲基化，從而恢復(fù)其mRNA 和蛋白質(zhì)的表達，在基因表達調(diào)控、DNA 修復(fù)、基因穩(wěn)定等方面起重要作用［7］。TSA 是一種常用的組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑，能夠抑制HDAC 活性，使組蛋白高度乙?；?，以此來調(diào)節(jié)基因表達。近年來，研究發(fā)現(xiàn)CpG 島甲基化和組蛋白修飾既可獨立存在，也能相互影響［8］。有研究認為，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)抑制劑聯(lián)合應(yīng)用對恢復(fù)抑癌基因表達的作用可高于單獨應(yīng)用某一種［9-10］。

我們選擇SFRP1 基因mRNA 不表達且同時存在基因啟動子區(qū)高甲基化的EC9706 細胞株作為進一步研究對象，單獨給予DAC 及TSA 處理，均未能恢復(fù)SFRP1 基因的表達;但聯(lián)合DAC 和TSA 共同處理該細胞株后，SFRP1 基因表達卻得到了恢復(fù)，表明基因啟動子區(qū)甲基化和組蛋白乙酰化修飾可能共同參與了SFRP1 基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。國內(nèi)外其他研究也發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用DAC 及TSA 可有效恢復(fù)Wnt 相關(guān)基因mRNA 再表達［11-12］。

為進一步說明組蛋白乙?；虳NA 甲基化共同參與了SFRP1 在EC9706 細胞中的轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控過程，我們還用ChIP 方法以乙酰化組蛋白H3、H4 抗體免疫沉淀染色質(zhì)片段，然后PCR 擴增SFRP1 基因啟動子區(qū)，擴增出SFRP1 基因啟動子區(qū)片段后進行克隆測序，測序結(jié)果證實為SFRP1 基因啟動子區(qū)序列，從而表明SFRP1 基因啟動子區(qū)結(jié)合有乙酰化組蛋白H3 及H4，進一步說明組蛋白乙酰化和DNA 甲基化共同參與了SFRP1 在EC9706 細胞中的轉(zhuǎn)錄表達的調(diào)控過程。

綜上所述，本研究結(jié)果證實，ESCC 中存在SFRP1基因的表達下調(diào)和SFRP1 基因啟動子區(qū)高甲基化及組蛋白乙?；?，去甲基化制劑DAC 和HDAC 抑制劑共同作用可恢復(fù)SFRP1 基因轉(zhuǎn)錄表達。從實驗中我們可以進一步推測，SFRP1 基因作為一個可能的抑癌基因，其異常表達和啟動子區(qū)高甲基化可能通過Wnt 通路參與了ESCC 的發(fā)病過程，未來可能為ESCC 患者的診治提供新的方向，但仍需要進一步的實驗及臨床研究來證實。

［1］ Valcz G，Patai AV，Kalmár A，et al. Myofibroblast-derived SFRP1 as potential inhibitor of colorectal carcinoma field effect［J］. PLoS One，2014，9 (11):e106143.

［2］ Suzuki H，Gabrielson E，Chen W，et al. A genomic screen for genes upregulated by demethylation and histone deacetylase inhibition in human colorectal cancer［J］. Nat Genet，2002，31(2):141-149.

［3］ Wang S，Dorsey TH，Terunuma A，et al. Relationship between tumor DNA methylation status and patient characteristics in African-American and European-American women with breast cancer［J］. PLoS One，2012，7(5):e37928.

［4］ Armes JE，Hammet F，de Silva M，et al. Candidate tumor-suppressor genes on chromosome arm 8p in early-onset and high-grade breast cancers［J］. Oncogene，2004，23(33):5697-5702.

［5］ Awakura Y，Nakamura E，Ito N，et al. Methylation-associated silencing of SFRP1 in renal cell carcinoma［J］. Oncol Rep，2008，20(5):1257-1263.

［6］ Ishii T，Murakami J，Notohara K，et al. Oesophageal squamous cell carcinoma may develop within a background of accumulating DNA methylation in normal and dysplastic mucosa［J］. Gut，2007，56(1):13-19.

［7］ Fulda S，Kufer MU，Meyer E，et al. Sensitization for death receptoror drug-induced apoptosis by re-expression of caspase-8 through demethylation or gene transfer ［J］. Oncogene，2001，20 (41):5865-5877.

［8］ Sarkar S，Horn G，Moulton K，et al. Cancer development，progression，and therapy:an epigenetic overview［J］. Int J Mol Sci，2013，14(10):21087-21113.

［9］ Steele N，F(xiàn)inn P，Brown R，et al. Combined inhibition of DNA methylation and histone acetylation enhances gene re-expression and drug sensitivity in vivo［J］. Br J Cancer，2009，100(5):758-763.

［10］ Cameron EE，Bachman KE，Myohanen S，et al. Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in the re-expression of genes silenced in cancer［J］. Nat Genet，1999，21(1):103-107.

［11］ Gotze S，Wolter M，Reifenberger G，et al. Frequent promoter hypermethylation of Wnt pathway inhibitor genes in malignant astrocytic gliomas［J］. Int J Cancer，2010，126(11):2584-2593.

［12］ Qi J，Zhu YQ，Luo J，et al. The role of secreted Wnt-antagonist genes hypermethylation in early detection of colorectal tumor ［J］.Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2007，87(28):1954-1957.