黃 瀟 肖 雄 高文軍 陳 瑤

江西中醫(yī)藥大學藥學院，江西南昌 330004

梔子為常用中藥，在我國應(yīng)用歷史悠久，歷代主要本草著作中均有收錄。國內(nèi)外從19世紀末開始對梔子屬植物進行大量化學成分方面的研究［1-5］，目前為止，從梔子中發(fā)現(xiàn)了大量的多酚類化合物。多酚類化合物是一類復(fù)雜的具有多個酚羥基的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化性［6］、清除自由基、降血脂、降血壓、降血糖［7-8］、抗腫瘤［9-10］、抗衰老、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌等作用［11］。

近年來，響應(yīng)面優(yōu)化法在中藥提取工藝、中藥制劑工藝、中藥處方篩選中已有大量應(yīng)用［12］，而Placket-Burman試驗可從大量影響因子中篩選出顯著因子，最速上升試驗又可將顯著因子最大程度逼近中心點，故此在優(yōu)選響應(yīng)面顯著因子方面最為準確有效［13］。本研究利用Placket-Burman試驗篩選出乙醇濃度、液料比、提取時間三個顯著因素、采用最速上升試驗確定響應(yīng)面分析的中心點，最終通過Box-Behnken試驗響應(yīng)面分析，優(yōu)化了梔子總多酚的超聲提取的工藝，為梔子的開發(fā)利用提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子（江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司），經(jīng)江西中醫(yī)藥大學范崔生教授鑒定為梔子（Gardenia jasminoidesEllis）的果實，烘干，粉碎，過篩，備用。

沒食子酸標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號110813-201204），95％乙醇、85％濃磷酸、37％濃鹽酸（汕頭市西朧化工有限公司），無水碳酸鈉、硫酸鋰、溴水（天津市風船化學試劑科技有限公司），鉬酸鈉、鎢酸納（天津市化學試劑四廠）所有試劑均為分析純。Folin-Ciocalten（FC）試劑：參照文獻［14］自配。

1.2 實驗儀器

KQ-300超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司），0412-CENTRIRIFUGE離心機（上海方術(shù)器械廠），BS224S電子天平（北京塞多利器有限公司），YF-116搖擺式粉碎機（浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司），UV-2100紫外分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 沒食子酸標準曲線繪制 稱取沒食子酸標準品10mg，用80％乙醇定容至100mL容量瓶。分別移取沒食子酸標準品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mL于10mL容量瓶，加水至4.0mL后，加入2mL FC試劑搖勻，靜置5min；再加入10％碳酸鈉溶液2mL，用水定容至刻度，搖勻，避光放置2h，以80％乙醇溶液作空白組，于波長764nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，沒食子酸濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=0.095X-0.103，相關(guān)系數(shù)R2=0.9980。

1.3.2 梔子總多酚的測定方法［15］精密稱取梔子粉末0.5g，在一定條件下超聲提取，定容至20mL，取一定量上清液于10mL容量瓶，加水至4.0mL，先加入2mL FC試劑，搖勻，靜置5min；再加入2mL 10％碳酸鈉溶液，用水定容至刻度，搖勻，避光放置2h，以試劑作空白組，測定其在波長764nm處的吸光度，通過沒食子酸標準曲線計算所測樣品的濃度，按下式計算梔子總多酚含量，每組試驗平行3次。

總多酚含量（％）=提取出的多酚類化合物量/梔子量×100％。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman（PB）試驗

PB試驗是一種通過N次試驗可以研究最多K=N-1個變量（N一般為4的倍數(shù)）的兩水平的實驗設(shè)計方法，能夠通過比較各因素兩水平的差異與整體的差異來確定其顯著性，從而達到篩選顯著因素的目的，可以避免在之后的優(yōu)化試驗中由于因素太多或部分因素不顯著而造成的試驗成本浪費［16-17］。

考察梔子總多酚超聲提取的7個影響因素，各因素以及水平的選擇來源于單因素預(yù)實驗：X1為乙醇濃度、X2為粒徑、X3為液料比、X4為超聲功率、X5為提取溫度，X6為提取時間，X7為提取次數(shù)，X8為虛構(gòu)變量用以估算誤差。每個因素分別選取高水平（1）和低水平（-1），以梔子總多酚提取率為響應(yīng)值，用Design-Expert.8.05b軟件設(shè)計試驗并進行數(shù)據(jù)處理。PB試驗設(shè)計因素及水平編碼見表1，實驗設(shè)計及響應(yīng)值見表2，方差分析見表3。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計方差分析表

Design-Expert.8.05b軟件擬合出多項式方程如下：

Y=-1.41+1.6×10-2X1-9.2×10-2X2+1.6×10-2X3+3.5×10-3X4+2.9×10-3X5+1.3×10-2X6+2.6×10-2X7

由表3可以看出，模型R2=0.9788，表明有97.88％試驗數(shù)據(jù)的差異可用該模型解釋。R2

adj=0.9418與R2接近，能夠更好的看出模型的解釋力。各因素對響應(yīng)值的影響由P值決定，P＜0.05時，該因素對總多酚的提取為顯著因素，反之不顯著。表3及擬合多項式可以看出，乙醇濃度X1、料液比X3、提取時間X6為顯著因素，對提取率的影響均為正相關(guān)，顯著程度為X3＞X1＞X6。

2.2 最速上升試驗

最速上升試驗，又叫最陡爬坡試驗，能夠快速的將各因素水平趨近最優(yōu)響應(yīng)值，最終建立有效的響應(yīng)面擬合方程［18］。根據(jù)PB試驗的結(jié)果，進行最速上升試驗。由PB試驗結(jié)果可知，乙醇濃度、料液比、提取時間對梔子總多酚得率有顯著影響，因此按這三個因素效應(yīng)的大小比例設(shè)定最速上升路徑和步長。乙醇濃度、料液比、提取時間的均為正相關(guān)，三因素的水平均為遞增，試驗設(shè)計和結(jié)果見表4。由表4可知，梔子多酚得率最大值在試驗4附近，因此選擇試驗4中各參數(shù)值為后續(xù)Box-Behnken試驗的中心點。

表4 最速上升實驗設(shè)計及結(jié)果

2.3 Box-Behnken試驗

采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗法，將乙醇濃度、液料比、提取時間三因素取三水平，編碼及水平見表5，試驗設(shè)計及結(jié)果見表6，方差分析見表7。

表5 Box-Behnken試驗因素及水平

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

Design-Expert.8.05b擬合出多項式方程如下：

Y=-24.35+0.47A-0.35B+0.64C+1.0×10-4AB-2.6×10-3AC-3.05×10-18BC-4.29×10-3A2-7.09B2-7.39C2

表7中，P＜0.05表明模型或考察的因素有顯著影響。模型的P＜0.0001，表明模型顯著性很高；模型失擬項P值為0.1097，大于0.05，表示失擬項不顯著；模型的R2=0.9971，R2adj=0.9934，表明模型的相關(guān)性和解釋度都很好。表7的結(jié)果中，由P值大小來判斷，乙醇濃度A、料液比B、提取時間C三個因素對響應(yīng)值的大小影響為B＞A＞C，同時AC、A2、B2、C2的P值均＜0.05，對響應(yīng)值有顯著影響。

圖1為Design-Expert.8.05b軟件擬合的二次回歸響應(yīng)面3D圖，結(jié)合表7結(jié)果可以看出乙醇濃度、料液比、提取時間兩兩因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，PAC＞PAB＞PBC，響應(yīng)值存在極值，經(jīng)Design-Expert.8.05b進一步計算得出：當乙醇濃度為44.53％，液料比25.26mL/g，提取時間為35.28min時，梔子總多酚提取率有最大值，為1.9％。

2.4 驗證試驗

為檢驗Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化模型的可靠性，依據(jù)實際情況，將提取條件調(diào)整為乙醇濃度45％，液料比25mL/g，提取時間為35min，平行試驗3次，取平均值，得到實際提取率為1.857％，與預(yù)測值1.9％接近，表明采用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化的梔子總多酚超聲提取模型準確可靠。

表7 Box-Behnken實驗結(jié)果方差分析表

圖1 各因素兩兩因素的交互作用對多酚提取率影響的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

本研究采用PB試驗法、最速上升試驗法、和Box-Behnken試驗法，確定影響梔子總多酚超聲提取率3個顯著因素為乙醇濃度、液料比、提取時間，在最佳工藝條件：乙醇濃度為44.53％，液料比25.26mL/g，提取時間為35.28min下，梔子總多酚得率預(yù)測值為1.9％。依據(jù)實際情況將最佳工藝條件調(diào)整為乙醇濃度45％，液料比25mL/g，提取時間為35min，經(jīng)驗證試驗表明，此條件下梔子總多酚得率為1.857％，與預(yù)測值1.9％接近，表明了響應(yīng)面模型的可靠性和準確定性，為梔子做為天然抗氧化劑來源的開發(fā)和利用提供了參考。

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