楊毅生 鐘瑞建 洪 挺 王 棟

1.江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院 江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，江西南昌330029；2.江西省食品檢驗(yàn)檢測研究院，江西南昌 330046

野木瓜注射液為野木瓜經(jīng)提取制成的滅菌水溶液，為中醫(yī)臨床常用中藥注射劑［1］，具有祛風(fēng)止痛，舒筋活絡(luò)之功效，用于風(fēng)邪阻絡(luò)型三叉神經(jīng)痛、坐骨神經(jīng)痛［2-3］?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第二十冊第328頁（標(biāo)準(zhǔn)號：WS3-B-4003-98），采用紫外-可見分光光度法測定總黃酮（以蘆丁計(jì)）的含量來評價(jià)野木瓜注射液的質(zhì)量，由于野木瓜注射液是由野木瓜藥材通過醇提酸沉，再經(jīng)堿調(diào)pH中性后醇沉制成的注射液，成分復(fù)雜，僅以單一指標(biāo)評價(jià)不能全面反映中藥注射劑內(nèi)在質(zhì)量，指紋圖譜是揭示中藥內(nèi)在物質(zhì)概貌的重要手段。中藥指紋圖譜是運(yùn)用現(xiàn)代分析技術(shù)對中藥化學(xué)信息以圖（圖像）的方式進(jìn)行表征并加以描述的一種綜合的、可量化的化學(xué)鑒定手段［4］?，F(xiàn)階段中藥的有效成分大多數(shù)尚不明確，中藥指紋圖譜的整體性和模糊性正好適應(yīng)這一特點(diǎn)［5］，較單一成分的質(zhì)量控制方法更具有科學(xué)性和全面性。整體性是指中藥化學(xué)成分的整體組成的特性，即圖譜應(yīng)能相對全面、系統(tǒng)地體現(xiàn)中藥成分的整體面貌。模糊性是指個(gè)體樣品本身就存在著未知因素，難以對所有化學(xué)成分進(jìn)行精確的定性、定量分析，故在解決實(shí)際問題時(shí)應(yīng)采用模糊數(shù)學(xué)等手段［6］。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，未見有野木瓜注射液指紋圖譜的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法建立野木瓜注射液指紋圖譜，應(yīng)用國家藥典委員會中藥色譜的指紋圖譜相似度評價(jià)軟件，對35批野木瓜注射液的HPLC指紋圖譜進(jìn)行了相似度計(jì)算，結(jié)果均大于0.90。從多維數(shù)字化角度、全方位揭示野木瓜注射液指紋圖譜特征和質(zhì)量變異，實(shí)現(xiàn)了對野木瓜注射液數(shù)字化的信息質(zhì)量控制與評價(jià)。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀，配有2996二極管陣列檢測器、低壓四元梯度泵、在線脫氣裝置、自動進(jìn)樣器、Empower色譜工作站。Milli-Q超純水儀，Sartorius BP211D電子天平，中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版（國家藥典委員會）。

乙腈為色譜純（MERCK），其他試劑試藥為分析純，超純水。木犀草素（批號：111520-200201，含量測定用）購自中國藥品生物制品檢定所。35批野木瓜注射液（江西天施康中藥股份有限公司提供11批，分別標(biāo)記為S1-S11；上海第一生化藥業(yè)有限責(zé)任公司提供13批，分別標(biāo)記為S12-S24；江西保利制藥有限公司提供11批，分別標(biāo)記為S25-S35）。

圖1 參照物溶液（A）和供試品溶液（B）HPLC圖

圖2 考察供試品溶液120min色譜圖

2 溶液制備

2.1 參照物溶液的制備

精密稱取木犀草素對照品10.5mg，置50mL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取25mL，置50mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為母液；精密量取1mL，置10mL量瓶中，加50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（每1mL含木犀草素0.0105mg）。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取野木瓜注射液和參照物母液各1mL，置10mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Zorbax SB-C18（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈（A）-0.5％冰醋酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～40min，95％→70％B；40～60min，70％→50％B），流速1.0mL/min，檢測波長為326nm，柱溫為25℃，進(jìn)樣量20μL。

為選取最佳的檢測波長，能較好地檢出供試品溶液各成分在上述液相色譜條件下的色譜信息，用PDA二極管陣列檢測器在全波段對各色譜峰進(jìn)行檢測考察，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)色譜峰的最大檢測波長在326nm附近，因此在試驗(yàn)過程中共比較了220、254、280和326nm四種波長，在這四種檢測波長下的HPLC譜圖均有多個(gè)色譜峰，以檢測波長為326nm時(shí)色譜峰較多、峰面積大、峰形對稱性較好且基線較平。因此選擇326nm為指紋圖譜檢測波長。

精密吸取參照物溶液和供試品溶液各20μL，分別進(jìn)樣測定，記錄色譜圖見圖1。比較保留時(shí)間確定供試品色譜圖中峰1為木犀草素峰，其理論板數(shù)不低于100 000?？疾旃┰嚻啡芤?20min色譜圖，結(jié)果無干擾峰出現(xiàn)，組分在60min內(nèi)基本洗脫完全（圖2）。

4 方法學(xué)考察

4.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液20μL，連續(xù)進(jìn)樣5次測定，所得圖譜導(dǎo)入軟件進(jìn)行分析，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間的RSD＜2％，相對峰面積的RSD除4號峰外，其余均＜3％，表明檢測系統(tǒng)的精密度合格。

4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取野木瓜注射液，制備成供試品溶液后分別在0、2、4、8、24h進(jìn)樣測定，所得圖譜導(dǎo)入軟件進(jìn)行分析，計(jì)算各共有峰相對保留時(shí)間的RSD＜1％，相對峰面積的RSD除4號峰外，其余均＜3％，表明供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取野木瓜注射液5份，分別制備供試品溶液并進(jìn)樣檢測，所得圖譜導(dǎo)入軟件進(jìn)行分析，結(jié)果各共有峰相對保留時(shí)間RSD＜1％，相對峰面積RSD除10號峰外，其余均＜3％，表明本實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

5 樣品測定及相似度計(jì)算

取10批野木瓜注射液（江西天施康中藥股份有限公司6批，分別為S1-S6；上海第一生化藥業(yè)有限責(zé)任公司提供2批，分別為S13、S14；江西保利制藥有限公司2批，分別為S26、S27），按選定的色譜條件進(jìn)行測定，用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版（國家藥典委員會）進(jìn)行色譜峰的匹配。通過對選定條件下10批野木瓜注射液的液體指紋圖譜進(jìn)行分析比較，可發(fā)現(xiàn)10批樣品都具有的主要色譜成分峰共有9個(gè)，見圖3。并生成野木瓜注射液標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，見圖4。

用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版考察35批野木瓜注射液樣品與標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的相似度，表明相似度均＞0.90。見表1。

圖3 10批野木瓜注射液HPLC指紋圖譜（9號峰為木犀草素峰）

6 討論

試驗(yàn)考察了5種流動相系統(tǒng)，梯度洗脫效果明顯優(yōu)于等度洗脫，并對梯度洗脫條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終確定為文中所述的洗脫條件。在同一臺液相色譜儀上，對Kromasil C18（5μm，250mm×4.6mm，MetaChem色譜柱）、Cosmosil C18（5μm，250mm×4.6mm，nacalai色譜柱）、Kromasil 100 C18（5μm，250mm×4.6mm，Kromasil色譜柱）、Zorbax SB C18（5μm，250mm×4.6mm，Agilent色譜柱）四種不同品牌的色譜柱進(jìn)行了考察比較試驗(yàn)，結(jié)果以上四種色譜柱均能使各共有峰得到較好分離，其中以Zorbax SB C18（5μm，250mm×4.6mm，Agilent色譜柱）的效果更好。以同一根Zorbax SB C18（5μm，250mm×4.6mm，Agilent色譜柱），分別在Waters 600_2996_717、Shimadzu 2010AHT、Agilent 1100三種不同品牌的液相色譜儀上進(jìn)行了考察比較試驗(yàn)，結(jié)果以上三種液相色譜儀均能使各共有峰得到較好分離。建立的分離檢測條件適用于野木瓜藥材、中間體及成品。建立野木瓜注射液指紋圖譜有利于更全面的控制和評價(jià)該制劑的質(zhì)量。野木瓜注射液組分分離及活性成分的結(jié)構(gòu)確證是當(dāng)前一大難題，有待繼續(xù)研究。

［1］中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn).中藥成方制劑［M］.第二十冊.WS3-B-4003-98：328.

［2］吳波，李祚雯.野木瓜注射液穴位注射治療坐骨神經(jīng)痛52例［J］.湖北中醫(yī)雜志，2004，26（2）∶48.

［3］祖木來提，李志東.野木瓜注射液穴位注射配合針灸治療坐骨神經(jīng)痛115例［J］.新疆中醫(yī)藥，2004，22（4）：29.

［4］劉軍紅，廖國玲.中藥指紋圖譜的研究綜述［J］.農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2009，30（2）：32-34.

［5］謝培山.色譜指紋圖譜分析是中草藥質(zhì)量控制的可行策略［J］.中藥新藥與臨床藥理，2001，12（3）∶141-145.

［6］李萍，劉耀.中藥指紋圖譜的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢［J］.中國藥業(yè)，2009，18（8）：19-21.