曹 娜 徐 濤

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合中心，山東青島 266021

新生兒圍產(chǎn)期窒息導(dǎo)致的缺氧缺血性腦損傷（hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是新生兒期的常見疾病，是導(dǎo)致兒童智能落后和腦性癱瘓、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)傷殘的主要原因之一。缺血缺氧性腦病后神經(jīng)細(xì)胞壞死及凋亡而導(dǎo)致神經(jīng)元大量缺失是其導(dǎo)致神經(jīng)功能缺損的病理基礎(chǔ)［1］。缺氧缺血腦損傷后PI3K-AKT信號(hào)通路中的p-AKT蛋白表達(dá)增加，并參與HIBD中的病理損傷過程，它通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵作用，同時(shí)具有減少氧自由基的生成、抑制炎癥反應(yīng)等作用。研究表明，PI3K-AKT通路的過度激活可導(dǎo)致腫瘤的出現(xiàn)［2］，但p-Akt蛋白的增加對(duì)缺血缺氧性腦病有保護(hù)作用。既往研究［3-4］發(fā)現(xiàn)，缺血可誘導(dǎo)p-AKT蛋白表達(dá)，隨著再灌注時(shí)間的延長其表達(dá)會(huì)下降。針刺治療對(duì)缺血缺氧性腦損傷具有獨(dú)特療效，但具體機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過建立新生大鼠缺血缺氧性腦損傷（hypoxic-ischemic encephalopatly，HIE）模型，觀察針刺百會(huì)、大椎、曲池、涌泉四穴對(duì)神經(jīng)細(xì)胞及p-AKT表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討針刺對(duì)缺血缺氧性腦損傷的療效及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及分組

SPF級(jí)7日齡SD大鼠90只，雌雄不限，體重14～18g，由青島市藥物檢測(cè)中心提供，合格證號(hào)：scxk魯20140003。室溫20～25℃，母鼠喂養(yǎng)。按區(qū)組隨機(jī)法分為兩組假手術(shù)組24只及HIE模型組66只。HIE模型組造模期間死亡18只。將最終造模成功的48只大鼠隨機(jī)分為兩組：模型組、針刺組。每組24只，于術(shù)后3d、7d、21d進(jìn)行取腦檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，每個(gè)時(shí)間段8只。

1.2 模型建立

大鼠經(jīng)乙醚吸入麻醉。采用Rice方法并加以改進(jìn)［5］，結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈，縫合切口。除假手術(shù)組，模型組和電針組大鼠置于透明密閉容器中以0.5L/min的速度通入低氧混合氣體（濃度為8％氧氣和92％氮?dú)猓?，建立缺氧缺血性腦損傷模型。缺氧1.5h后將大鼠放回鼠籠，術(shù)后2h仍未蘇醒或死亡的動(dòng)物剔除。

1.3 電針干預(yù)方法

（1）假手術(shù)組：僅分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈不作任何處理；（2）模型組：分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎，縫合切口，不另作任何治療；（3）電針組：缺血缺氧后第2天起，用0.5寸毫針，直刺大椎5mm；沿皮斜刺百會(huì)5mm、直刺曲池10mm、速刺涌泉微出血即可。百會(huì)、曲池與電針治療儀進(jìn)行連接，以穴位周圍皮膚微顫即適，非對(duì)稱雙向連續(xù)脈沖波、5～10Hz、3～5V，每日1次，每次10min。以上穴位定位參照大鼠常用的針灸穴位［6-7］。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 病理切片 每亞組隨機(jī)選取4只動(dòng)物，應(yīng)用10％水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)心臟灌注4％多聚甲醛溶液200mL，完整取腦，切取視交叉后腦組織（5mm）置4％多聚甲醛溶液后固定2h，蒸餾水浸泡4h。常規(guī)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，連續(xù)切片，厚5μm，貼片，4℃保存。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，蘇木精-伊紅染色，光鏡下神經(jīng)細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈不同程度的紅色。在400倍顯微鏡（德國，Leica DMI4000B）下，每張切片隨機(jī)觀察皮質(zhì)區(qū)4個(gè)不重疊的視野計(jì)數(shù)細(xì)胞，取其均值。以變性細(xì)胞指數(shù)（denatured cell index，DCI=變性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）表示損傷程度。

1.4.2 電鏡觀察 各組幼鼠于缺血缺氧后3d、7d、21d腹腔注射10％水合氯醛麻醉，心臟快速灌流生理鹽水50mL，斷頭取腦。在鼠腦前囟前后做冠狀切開，將腦皮質(zhì)區(qū)組織切成1mm厚度置于2.5％戊二醛中固定24h，1％鋨酸固定，梯度丙酮脫水，環(huán)氧丙烷置換，環(huán)氧樹脂Epon812包埋，超薄切片50nm，醋酸鈾+硝酸鉛雙染色，透射電鏡觀察神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)。

1.4.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 各組剩余4只幼鼠于缺血缺氧后3d、7d、21d腹腔注射10％水合氯醛麻醉，心尖部取血，在室溫下，血液自然凝固，以3000轉(zhuǎn)/min離心15min，取上清。p-Akt Elisa試劑盒（Lot.#：SO30708D）由Biosource International，Inc.USA提供，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。在全自動(dòng)酶標(biāo)儀450nm處讀板，以O(shè)D值和蛋白濃度為橫、縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出p-AKT的原始數(shù)據(jù)，根據(jù)待測(cè)蛋白的濃度和稀釋比例，即可計(jì)算出單位濃度總蛋白內(nèi)p-AKT的含量（unit/mg）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 HE染色

假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，排列整齊緊密，胞漿呈淡紅色，胞核呈藍(lán)色，核仁清晰，各時(shí)間點(diǎn)DCI水平較低無明顯差異（P＞0.05）。模型組3d，細(xì)胞質(zhì)染色不規(guī)則，細(xì)胞間隙擴(kuò)大，神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)濃縮、深染，DCI=0.60±0.03，較假手術(shù)組明顯升高（t=14.46，P＜0.05）；7d神經(jīng)元壞死明顯，排列紊亂，著色較深，常有核膜破裂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失，可見大量細(xì)胞核固縮深染、裂解；21d可見大量神經(jīng)細(xì)胞丟失，遺留大量空泡，DCI=0.78±0.05，為各組最高。電針組3d，神經(jīng)細(xì)胞損傷狀況同模型組，未見明顯變化，DCI=0.54±0.06，較同時(shí)間點(diǎn)模型組略低（t=1.69，P＞0.05）；7d可見部分神經(jīng)細(xì)胞固縮、深染，但壞死程度及DCI=0.42±0.04較同時(shí)間模型組（DCI=0.71±0.05）明顯減輕（t=8.83，P＜0.05）；21d神經(jīng)細(xì)胞腫脹變輕，排列有序，DCI=0.35±0.05，壞死細(xì)胞明顯減少。見圖1，表1～2。

圖1 大鼠皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，HE×400

表1 大鼠皮質(zhì)區(qū)DCI（±s）

表1 大鼠皮質(zhì)區(qū)DCI（±s）

注：同一時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 3d 7d 21d假手術(shù)組 0.13±0.05 0.12±0.04 0.13±0.04模型組 0.60±0.03* 0.71±0.05* 0.78±0.05*電針組 0.54±0.05* 0.42±0.04*# 0.35±0.05*#

表2 DCI方差分析

2.2 神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)

假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞排列整齊緊密，高倍鏡下細(xì)胞膜完整、細(xì)胞核大而圓。模型組術(shù)后1d電鏡下大鼠神經(jīng)元胞膜尚完整，核仁稍增大，常染色質(zhì)分布不均，線粒體輕度腫脹；3d鏡界模糊，有神經(jīng)細(xì)胞壞死征象，表現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞消失，染色質(zhì)聚集，雙層核膜模糊不清，21d神經(jīng)元損傷進(jìn)一步加重，細(xì)胞質(zhì)溶解，有空泡形成。電針組1d電鏡下神經(jīng)細(xì)胞的改變與模型組相比未見明顯差異；3d電鏡下，神經(jīng)元胞體水腫減輕，細(xì)胞核核膜、核仁逐漸清晰，細(xì)胞質(zhì)空白減少，針刺后21d大鼠神經(jīng)元與假手術(shù)組差別不明顯，胞膜尚完整，核質(zhì)稍疏松，常染色質(zhì)尚均勻，偶見腫脹的線粒體及擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。見圖2。

圖2 大鼠皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（21d），TEM×6K

2.3 ELISA

ELISA檢測(cè)顯示，假手術(shù)組大鼠p-Akt水平較低，各時(shí)間點(diǎn)間無明顯差異（P＞0.05）。模型組p-Akt表達(dá)升高，明顯高于同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組水平（P＜0.05），但隨著時(shí)間的延長，p-Akt表達(dá)逐漸下降。電針組p-Akt水平較高，且隨著治療時(shí)間的延長，p-Akt表達(dá)逐漸升高，3d時(shí)于模型組無明顯差異（t=0.94，P＞0.05），7d和21d時(shí)明顯高于模型組（t=9.43，16.02，P＜0.05）。見表3～4。

表3 大鼠血清pAkt表達(dá)（±s，units/mg）

表3 大鼠血清pAkt表達(dá)（±s，units/mg）

注：同一時(shí)間點(diǎn)，與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別 3d 7d 21d假手術(shù)組 12.16±2.39 11.91±2.56 12.42±2.53模型組 41.76±2.66* 32.03±1.98* 20.35±1.79*電針組 43.42±3.34* 48.73±2.38*# 59.17±2.63*#

表4 Elisa檢測(cè)大鼠血清Elisa方差分析

3 討論

新生兒缺氧缺血性腦病是指各種圍生兒期窒息引起的部分或完全缺氧，腦血流減少或暫停而導(dǎo)致胎兒或新生兒腦損傷，HIE是新生兒神經(jīng)發(fā)育異常和死亡的主要原因之一，可導(dǎo)致各種病發(fā)癥，如癲癇、腦癱、智力下降等，重度HIE預(yù)后不良率仍高達(dá)20.8％［8］，HIBD已經(jīng)成為全球范圍內(nèi)一個(gè)影響孩子們生活質(zhì)量的重要因素［9-10］。缺氧缺血性腦損傷的發(fā)病機(jī)制為二次損傷學(xué)說及細(xì)胞壞死，目前尚無有效的治療方法。許多研究表明有效針刺治療可抑制神經(jīng)元凋亡，并促進(jìn)各種內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌，但電針抑制神經(jīng)元凋亡的機(jī)制尚不明確，本文通過建立HIE大鼠模型，通過針刺百會(huì)、大椎、曲池、涌泉四穴，檢測(cè)p-Akt通道蛋白濃度變化，了解針刺治療缺血缺氧腦病的機(jī)制。

PI3K/Akt信號(hào)通路是與細(xì)胞凋亡有關(guān)的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，是重要的細(xì)胞存活信號(hào)通路之一［11］。許多研究表明［12-14］，通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路可導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生，抑制PI3K/Akt信號(hào)通路激活可達(dá)到治療腫瘤的目的，缺血缺氧性腦病早期便可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的過度壞死及凋亡［15-16］。研究認(rèn)為，激活PI3K/AKT信號(hào)通路是電針對(duì)腦細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制之一［9，17］，可在不同時(shí)間點(diǎn)不同程度的降低凋亡細(xì)胞百分率，通過本實(shí)驗(yàn)通過病理及電鏡觀察到針刺7d、21d神經(jīng)元細(xì)胞損傷明顯減輕，Elisa檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，電針組細(xì)胞中p-Akt蛋白濃度較模型組明顯升高（P＜0.05），可見針刺對(duì)缺血缺氧性腦病有治療作用。且有研究顯示電針百會(huì)、大椎及涌泉等穴可提高線粒體Na+-K+-ATP等酶的活性，進(jìn)而提高線粒體的能量代謝能力，從而減輕腦缺血再灌注損傷［18-20］。由此提示，電針治療缺血缺氧性腦病是通過多途徑、作用于多環(huán)節(jié)或多靶點(diǎn)來實(shí)現(xiàn)的。目前針灸對(duì)缺血性腦損傷的諸多保護(hù)機(jī)制還尚未完全明了，需要應(yīng)用生物化學(xué)、生理學(xué)等新知識(shí)及新技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步研究，電針對(duì)于p-Akt蛋白表達(dá)增加只是治療HIE的很小的一部分，還需要進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

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