徐尚榮（青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016）

5個(gè)綿羊品種Cytb基因序列多態(tài)性及系統(tǒng)進(jìn)化研究

徐尚榮
（青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016）

利用克隆測序方法對(duì)杜泊羊、藏羊、小尾寒羊、哈薩克羊和阿勒泰羊DNA細(xì)胞色素b基因全序列進(jìn)行克隆和測序，并對(duì)基因特點(diǎn)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析。結(jié)果表明：5個(gè)綿羊品種線粒體細(xì)胞色素b基因全長1 140 bp，基因特點(diǎn)顯示A+T含量（58.6%)比G+C（41.4%）含量高，表現(xiàn)出一定的堿基偏好，轉(zhuǎn)換多于顛換，表現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)換偏向；基于線粒體細(xì)胞色素b基因構(gòu)建了5個(gè)綿羊品種的NJ樹，表明阿勒泰羊與哈薩克羊親緣關(guān)系最近，杜泊羊與阿勒泰羊親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

綿羊；細(xì)胞色素b基因（Cytb）；系統(tǒng)進(jìn)化

高等動(dòng)物線粒體是共價(jià)閉合的環(huán)狀雙鏈DNA分子，具有較高的突變率和母系遺傳特征，其中細(xì)胞色素b （Cytb）基因是線粒體基因中研究較為清楚的遺傳標(biāo)記，特別適合種內(nèi)、種間及種以上分類階元的進(jìn)化研究［1-6］。

杜泊羊原產(chǎn)于南非，是由無角陶賽特羊和黑頭珀翔羊雜交，經(jīng)大量雜交選育而形成的肉用新品種羊。因其適應(yīng)性強(qiáng)，早期生長發(fā)育快，遺傳性穩(wěn)定，胴體質(zhì)量好，被譽(yù)為“鉆石級(jí)”肉用綿羊而聞名于世［7-8］；藏羊、小尾寒羊、哈薩克羊和阿勒泰羊具有優(yōu)良種質(zhì)特性，是我國優(yōu)良地方綿羊品種［9］。

鞏元芳等［10］用DNA（mtDNA）細(xì)胞色素b基因研究了幾個(gè)地方綿羊品種線粒體多態(tài)性，表明我國地方綿羊品種的起源可能是單一的。管松等［11］研究了中國西南地區(qū)5個(gè)地方綿羊群體mtDNA遺傳多樣性，得出西藏綿羊有3個(gè)母系來源，云南綿羊有2個(gè)母系來源。張傳生等［12］研究了5個(gè)綿羊品種線粒體DNA基細(xì)胞色素b（Cytb）基因片段，推測出其中4個(gè)品種綿羊具有共同的母系祖先。因此，mtDNA Cytb基因可以作為一種遺傳標(biāo)記，用來研究綿羊的起源進(jìn)化以及親緣關(guān)系。本研究以杜泊羊、藏羊、小尾寒羊、哈薩克羊和阿勒泰羊?yàn)椴牧?，測定5個(gè)綿羊品種mtDNA Cytb基因序列，并進(jìn)行對(duì)比分析，以期為綿羊品種的起源分化及遺傳親緣關(guān)系研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用杜泊羊、藏羊和小尾寒羊血液采自青海，哈薩克羊和阿勒泰羊血液采自新疆，各30只，所采血樣均為6mL，ACD抗凝，-20℃凍存。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 基因組總DNA的提取，按照天根生物有限公司動(dòng)物組織DNA提取試劑盒說明書操作。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與線粒體DNA細(xì)胞色素b基因片段的擴(kuò)增 在GenBank下載綿羊Cytb基因的序列（登錄號(hào)為：NC009510），用DNAMAN進(jìn)行比對(duì)，查出保守序列，利用primer5設(shè)計(jì)引物，根據(jù)目的基因Cytb、pGM-T載體的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)兩端含有限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的引物，正鏈為：5′-atgatcaacatccgaaaaacc-3′，反鏈為：5′-tcttcattttaggaggt-3′。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：各綿羊DNA樣品1μL（75 ng/μL），10×Buffer 2.5μL，2.5 mmol/L的dNTP 2μL，25 mmol/LMgCl21μL，正向引物和反向引物（10μmol/L）各為1μL，TaqDNA聚合酶0.3μL（5U/μL），加滅菌雙蒸水至25μL。未加DNA樣品為陰性對(duì)照。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，2min預(yù)變性；94℃、60 s，44℃、60 s，72℃、90 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增效率。

1.2.3 純化與測序 用北京百泰克生物技術(shù)有限公司回收試劑盒進(jìn)行純化與回收，將Cytb的PCR純化產(chǎn)物與pGM-T連接并轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5a，進(jìn)行藍(lán)白斑鑒定，篩選陽性克隆，并命名為PGM-T-Cytb。對(duì)陽性克隆進(jìn)行PCR和EcoR I酶切鑒定，對(duì)鑒定正確的質(zhì)粒送由上海生工進(jìn)行測序。

1.2.4 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建運(yùn)用ClustalX軟件將測得序列進(jìn)行比對(duì)，輔以人工校正。利用MEGA 3.1軟件對(duì)各綿羊品種Cytb基因序列進(jìn)行種內(nèi)和種間差異評(píng)估［13-14］，用鄰接（Neighbour-Joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度由1 000次自舉法（Bootstrap）檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果與酶切鑒定

根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物對(duì)杜泊羊、藏羊、小尾寒羊、哈薩克羊和阿勒泰羊5個(gè)綿羊品種進(jìn)行mtDNA Cytb基因的PCR擴(kuò)增。結(jié)果擴(kuò)增出了預(yù)期的PCR產(chǎn)物（見圖1），藍(lán)白斑篩選后對(duì)陽性克隆進(jìn)行酶切鑒定（見圖2）。

圖1 mtDNA Cytb基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 PGM-T-Cytb的酶切鑒定

2.2 mtDNA Cytb基因序列變異特點(diǎn)

對(duì)本實(shí)驗(yàn)測定的杜泊羊、藏羊、小尾寒羊、哈薩克羊和阿勒泰羊的細(xì)胞色素b基因序列進(jìn)行比對(duì)。同源比對(duì)并剪切非目的序列后得到1 140 bp的同源基因序列。在研究的5個(gè)綿羊品種序列中，A、T、C、G堿基的平均含量分別為31.5%、27.1%、28.5%和12.9%（見表1）。A+T的含量為58.6%，顯著高于G+C的含量41.4%。其中G的含量在第3位密碼子上較低，阿勒泰羊?yàn)?.9%、藏羊?yàn)?.2%、杜泊羊?yàn)?.4%；第2位的T含量較高，平均為42.1%。測定的5個(gè)綿羊品種Cytb基因序列共發(fā)現(xiàn)15個(gè)變異位點(diǎn)分別位于207、292、309、328、393、396、476、495、696、735、813、933、939、990、997，占分析位點(diǎn)總數(shù)的1.13%。這些變異位點(diǎn)包含13個(gè)轉(zhuǎn)換和2個(gè)顛換，其中T-C的轉(zhuǎn)換比A-G轉(zhuǎn)換發(fā)生的多，A-T顛換高于C-G顛換，未檢測到A-C和T-G的顛換，核苷酸的替換主要以轉(zhuǎn)換為主，轉(zhuǎn)換多于顛換，表現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)換偏向。

2.3 5 個(gè)綿羊品種間的遺傳距離

使用MEGA軟件的nucleotide Kimura2-parameter模型計(jì)算5個(gè)綿羊品種間的遺傳距離（見表2）。從Kimura雙參數(shù)距離可以看出，不同綿羊品種之間的距離差異比較大，從0.000 76～0.012 43，其中哈薩克羊與阿勒泰羊間的Kimura雙參數(shù)（2-parameter）遺傳距離最?。?.000 76）、杜泊羊與哈薩克羊間的Kimura雙參數(shù)（2-parameter）遺傳距離最大（0.012 43）。

表1 5個(gè)綿羊品種細(xì)胞色素b基因的密碼子組成%

表2 5個(gè)綿羊品種細(xì)胞色素b基因序列的雙參數(shù)距離

2.4 5 個(gè)綿羊品種系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用本實(shí)驗(yàn)測定的杜泊羊、藏羊、小尾寒羊、哈薩克羊和阿勒泰羊的細(xì)胞色素b基因序列，通過MEGA 3.1軟件基于Kimura兩參數(shù)距離采用鄰位相接法（NJ）（見圖3），構(gòu)建5個(gè)品種綿羊的系統(tǒng)發(fā)育樹。哈薩克羊與阿勒泰羊序列聚集在一起，提示它們可能起源同一母系。哈薩克羊、阿勒泰羊序列與藏羊序列交錯(cuò)聚在一起（BCL=100%），說明它們的親緣關(guān)系比較近。

圖3 基于Cytb基因序列構(gòu)建的5個(gè)綿羊品種NJ樹

3 討論

基于GenBank已公布的綿羊Cytb基因的保守序列，成功擴(kuò)增出杜泊羊、藏羊、小尾寒羊、哈薩克羊和阿勒泰羊Cytb基因序列全長為1 140 bp。A+T的含量為58.6%，顯著高于G+C的含量41.4%，其中G的含量在第3位密碼子上較低，阿勒泰羊?yàn)?.9%、藏羊?yàn)?.2%、杜泊羊?yàn)?.4%，表現(xiàn)出一定的堿基偏好，與以往研究的哺乳動(dòng)物Cytb基因堿基偏好一致［15-16］；測定的5個(gè)綿羊品種Cytb基因序列共發(fā)現(xiàn)15個(gè)變異位點(diǎn)，這些變異位點(diǎn)包含13個(gè)轉(zhuǎn)換和2個(gè)顛換，其中T-C的轉(zhuǎn)換比A-G轉(zhuǎn)換發(fā)生的多，A-T顛換高于C-G顛換，未檢測到A-C和T-G的顛換，核苷酸的替換主要以轉(zhuǎn)換為主，轉(zhuǎn)換多于顛換，表現(xiàn)較高的轉(zhuǎn)換偏向。

細(xì)胞色素b基因已成為研究生物進(jìn)化史和分類的重要工具［17-19］。近年來，細(xì)胞色素b基因在綿羊不同種內(nèi)種間的系統(tǒng)發(fā)生和群體進(jìn)化方面得到廣泛應(yīng)用［20］。本研究測定的5個(gè)綿羊品種遺傳距離在0.000 76～0.012 43之間，其中哈薩克羊與阿勒泰羊間的遺傳距離最小，為0.000 76，杜泊羊與哈薩克羊間的遺傳距離最大，為0.012 43，結(jié)果提示與這些羊的起源、分化及地理分布一致。

本研究對(duì)杜泊羊、藏羊、小尾寒羊、哈薩克羊和阿勒泰羊Cytb基因進(jìn)行克隆，并初步分析了5個(gè)綿羊品種Cytb基因序列變異特點(diǎn)和系統(tǒng)進(jìn)化，為了解綿羊線粒體基因組的遺傳特點(diǎn)和綿羊品種的起源、分化及親緣關(guān)系提供一定的理論依據(jù)。

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Study on Polym orphism of Cytb and Phylogeny Evolution of Five Sheep Breeds

Xu Shangrong
（QinghaiAcademy ofAnimaland Veterinary Science，Xining 810016，China）

The experiment cloned and sequenced the whole sequences of mitochondrial DNA cytochrome b gene from Dorper sheep，Tibetan Sheep，Small TailHan Sheep，Kazak sheep and Altay sheep.The genetic characteristicsand phylogenywere analyzed.The resultsshowed that the complete length ofmitochondrialDNA cytochromeb gene in the fivesheep breedswas1 140 bp. The nucleotide contentof A+T（58.6%）washigher than thatofG+C（41.4%），indicating basespreference.Transitionsweremore than transversions，indicating the high transitionspreference.The NJtree of five sheep breedswas constructed based onmitochondrial cytochrome b gene.In the tree，the genetic relationship between Altay sheep and Kazak sheep were the closest，while the relationship between Dorpersheep and Altay sheepwere the farthest.

sheep；cytochromeb gene；phylogeny

S826.2

A

2095-3887（2015）04-0009-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.003

2015-06-23

國家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2013GA870006）、（2014GA870001）；青海省科技促進(jìn)新農(nóng)村計(jì)劃項(xiàng)目（2013-N-516）、（2013-N-517）

徐尚榮（1970-），男，副研究員。研究方向：動(dòng)物繁殖。