古麗格娜，艾買提·買買提，於建國，郝 耿，楊會國，儲明星，買買提明，郭曉飛，潘章源，狄 冉，劉秋月（.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊80000；.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，北京009；.新疆畜牧廳南山種羊場）

遺傳育種

7種綿羊和4種山羊GDF9基因G1突變檢測

古麗格娜1，艾買提·買買提1，於建國1，郝 耿1，楊會國1，儲明星2，買買提明3，郭曉飛2，潘章源2，狄 冉2，劉秋月2
（1.新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所，烏魯木齊830000；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部畜禽遺傳資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，北京100193；3.新疆畜牧廳南山種羊場）

前人研究表明生長分化因子9（GDF9）基因G1突變對部分綿羊品種的繁殖力有顯著影響。文章采用PCR-RFLP方法在不同繁殖力的7個綿羊品種（小尾寒羊、湖羊、洼地綿羊、陶賽特羊、特克塞爾羊、杜泊羊、德國肉用美利奴羊）和4個山羊品種（濟寧青山羊、貴州白山羊、遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊）中檢測GDF9基因G1突變，探究該突變與綿羊和山羊高繁殖力的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示：內(nèi)蒙古絨山羊沒有G1突變，只檢測到AA基因型；其余10個綿羊和山羊品種都有G1突變，均檢測到AA和AB兩種基因型。

綿羊；山羊；繁殖力；GDF9基因；PCR-RFLP

生長分化因子9（growth differentiation factor9，GDF9）是由卵母細(xì)胞分泌的一種因子，它通過旁分泌方式對卵泡的生長和分化起重要作用，且對卵巢顆粒細(xì)胞的增殖、卵丘的膨脹和卵泡膜的形成均有促進(jìn)作用［1-6］。綿羊GDF9基因定位于5號染色體標(biāo)記BM7247和SRCRSP14之間［7］。在綿羊體內(nèi)，GDF9基因在發(fā)育卵泡中特異性表達(dá)［8］；在山羊體內(nèi)，GDF9基因在整個發(fā)育過程的卵泡和黃體中都表達(dá)［9］。Hanrahan等［10］發(fā)現(xiàn)Cambridge和Belclare綿羊GDF9基因編碼區(qū)260 bp處存在一個堿基突變G→A，導(dǎo)致第87個氨基酸殘基由精氨酸改變?yōu)榻M氨酸，并且引起了HhaⅠ酶切位點的消失，將其命名為G1突變。

Barzegari等［11］和Javanmard等［12］報道，G1突變對一些綿羊品種的排卵數(shù)或產(chǎn)羔數(shù)有顯著影響。目前國內(nèi)有關(guān)GDF9基因G1突變與羊繁殖力關(guān)聯(lián)方面的報道比較少，僅有研究表明內(nèi)蒙古地區(qū)的德國肉用美利奴羊和新疆地區(qū)的巴音布魯克羊存在該突變［13-14］。本文以繁殖力存在差異的7個綿羊品種（小尾寒羊、湖羊、洼地綿羊、陶賽特羊、特克塞爾羊、杜泊羊、德國肉用美利奴羊）和4個山羊品種（濟寧青山羊、貴州白山羊、遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊）為實驗材料，采用PCR-RFLP方法檢測GDF9基因G1突變在不同綿羊和山羊品種中的分布差異，旨在尋找與繁殖力相關(guān)的遺傳標(biāo)記，為羊高繁殖力的標(biāo)記輔助選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小尾寒羊母羊40只，湖羊母羊30只，洼地綿羊母羊37只，陶賽特母羊40只，杜泊羊母羊38只，特克塞爾羊母羊40只，德國肉用美利奴羊母羊39只，濟寧青山羊母羊37只，貴州白山羊母羊36只，遼寧絨山羊母羊40只，內(nèi)蒙古絨山羊母羊40只。頸靜脈采血10mL/只，用檸檬酸葡萄糖抗凝，-20℃凍存。用酚氯仿抽提法提取基因組DNA，溶于TE緩沖液中，4℃保存。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶HhaⅠ、Taq DNA聚合酶、dNTPs均購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank公布的GDF9基因序列（GenBank：HE866499.1）設(shè)計引物，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。預(yù)計引物擴增片段為410 bp。引物堿基序列為：Forward：5′-GAAGACTGGTATGGGGAAATG-3′；Reverse：5′-CCAATCTGCTCCTACACACCT-3′。

1.4 PCR擴增

PCR擴增總體積為25μL，其中10×PCR緩沖液2.5μL（不含Mg2+），10μmol/L上下游引物各1.0μL，2.5mmol/L dNTPs2.0μL，25mmol/LMg2+1.5μL，50 ng/μL DNA模板2.5μL，2.5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，去離子水14.0μL。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30 s，60℃退火40 s，72℃延伸30 s，32個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 PCR-RFLP分析

引物的PCR擴增產(chǎn)物用HhaⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)總體積20μL，其中PCR產(chǎn)物4μL，10×緩沖液2.0μL，10 U/μL HhaⅠ限制性內(nèi)切酶0.5μL，去離子水13.5μL。均勻后振蕩、短暫離心（轉(zhuǎn)速達(dá)12 000 r/min即可）。酶切反應(yīng)條件為37℃水浴過夜。酶切產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。10μL酶切產(chǎn)物加2μL溴酚蘭（6×DNA Loading Buffer）上樣；DNAMarker I用量5μL；檢測電壓120 V、時間1 h。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增

對11個不同綿羊和山羊品種的基因組進(jìn)行PCR擴增，該擴增片段為GDF9基因G1突變所在區(qū)域，PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明，擴增片段與目的片段大小一致（410 bp）（見圖1），且條帶特異性好，可直接進(jìn)行RFLP分析。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳檢測

2.2 RFLP檢測

對11種羊的PCR擴增產(chǎn)物（410 bp）進(jìn)行酶切分析，結(jié)果如圖2所示，共檢測到兩種基因型。其中定義3條帶型（410 bp，254 bp，156 bp）為雜合型（AB），2條帶型（254 bp，156 bp）為純合型（AA）。

圖2 GDF9基因G1突變引物的PCR產(chǎn)物酶切

2.3 G1突變在11個羊品種中的等位基因頻率和基因型頻率

對11個羊品種進(jìn)行GDF9基因G1突變基因型檢測，計算了其基因型頻率和等位基因頻率（表1）。由表1可見，內(nèi)蒙古絨山羊沒有G1突變，僅檢測到AA型；其余10個綿羊和山羊品種都有G1突變，且均檢測到AA、AB兩種基因型。

表1 GDF9基因G1突變在11個羊品種中的等位基因頻率和基因型頻率

3 討論

大量研究表明，GDF9基因在人、嚙齒類動物以及反芻家畜卵母細(xì)胞中均特異性表達(dá)，它對卵巢卵泡的發(fā)育起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［7-8，15-19］。GDF9可以促進(jìn)原始卵泡向初級卵泡發(fā)育，GDF9基因缺陷型母羊的卵母細(xì)胞能夠發(fā)育到正常大小，但不能完成有絲分裂，并停止于初級卵泡階段；其卵巢表面外觀呈現(xiàn)“斑紋”狀，且上皮顆粒脫落，卵泡周圍的顆粒細(xì)胞也呈現(xiàn)異常狀態(tài)［20］。Dong等［16］將敲除了GDF9基因外顯子2的兩只雜合子（gdf9ml/+）小鼠進(jìn)行雜交，發(fā)現(xiàn)純合子（gdf9ml/gdf9ml）雄性小鼠能正常繁殖，而純合子（gdf9ml/gdf9ml）雌性小鼠則表現(xiàn)為不育，主要原因是GDF9缺陷型的純合子雌性小鼠卵泡發(fā)育到初級卵泡就停止而不能繼續(xù)生長分化。

GDF9基因在不同綿羊、山羊品種中存在多個位點突變，其多態(tài)性較豐富［10-12，21-30］。Hanrahan等［10］用PCR-SSCP和直接測序的方法共發(fā)現(xiàn)綿羊GDF9基因上有8個突變，分別命名為G1～G8，其中5個（G1、G4、G6、G7、G8）位點突變導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄后氨基酸水平的變化。最值得研究者們關(guān)注的G8突變又命名為FecGH，是位于編碼區(qū)1 184 bp處的C→T堿基突變，導(dǎo)致氨基酸序列第395位的絲氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楸奖彼幔撏蛔冸s合子在Belclare母綿羊和Cambridge母綿羊上表現(xiàn)為排卵數(shù)顯著增加，而其純合子Belclare母綿羊和Cambridge母綿羊則表現(xiàn)為不育。G8突變對Belclare綿羊和Cambridge綿羊排卵數(shù)的增加效應(yīng)分別為1.79枚±0.55枚（P＜0.01）和2.35 枚±0.39枚（P＜0.001）。

針對G1突變，Barzegari等［11］在伊朗的Moghani和Ghezel綿羊、Polley等［21］在印度的Garole綿羊、Roy等［22］在印度的Bonpala綿羊、Liandris等［31］在希臘的Chios綿羊和Karagouniki綿羊、Paz等［32］在智利的Araucano Creole綿羊群體中均檢測到該突變。Barzegari等［11］報道，在97個個體中，5只G1位點野生型的個體產(chǎn)雙羔（6.3%）；13只G1位點突變雜合型個體中，7只產(chǎn)雙羔（53.8%）；4 只G1位點突變純合型個體都能繁殖，且產(chǎn)單羔；僅1只母羊因同時攜帶GDF9基因G1純合子突變和BMP15基因B2純合子突變而不育。Barzegari等［11］認(rèn)為在Moghani 和Ghezel綿羊群體中，同時攜帶G1和B2雜合突變的個體排卵數(shù)更高，即高于攜帶單個突變的個體，并猜測這兩個基因的突變對排卵數(shù)效應(yīng)是相等的。Javanmard等［12］在伊朗脂尾型地毯毛綿羊品種（Afshari=19、Baluchi=18、Makui=30和Mehraban=30）中檢測到BMP15基因B2突變和GDF9基因G1突變，其中在Baluchi和Makui品種中檢測到突變純合子。研究表明，B2或G1突變可顯著提高以上綿羊品種的產(chǎn)羔數(shù)（P＜0.01），單獨攜帶B2或G1突變的純合子個體也表現(xiàn)出正常的生殖能力，沒有檢測到同時攜帶B2和G1突變的個體。4個綿羊品種G1突變雜合個體平均每胎產(chǎn)羔數(shù)為1.78只±0.07只（n=38），顯著高于野生型個體平均每胎產(chǎn)羔數(shù)1.16只± 0.05只（n=58）（P≤0.01）。Liandris等［31］統(tǒng)計Chios綿羊產(chǎn)羔數(shù)后發(fā)現(xiàn)，G1突變純合子平均產(chǎn)羔數(shù)2.25只，顯著高于其雜合子（平均產(chǎn)羔數(shù)為1.45只）和野生型純合子（平均產(chǎn)羔數(shù)為1.59只）（P≤0.05）。Barzegari等［11］、Javanmard等［12］和Liandris等［31］均發(fā)現(xiàn)，G1突變純合子在所研究的綿羊個體上都繁育正常，未出現(xiàn)純合子不育現(xiàn)象。

本研究在不同繁殖力的7個綿羊品種（小尾寒羊、湖羊、洼地綿羊、陶賽特羊、特克塞爾羊、杜泊羊、德國肉用美利奴羊）和4個山羊品種（濟寧青山羊、貴州白山羊、遼寧絨山羊、內(nèi)蒙古絨山羊）中檢測了G1突變。結(jié)果顯示：內(nèi)蒙古絨山羊均為AA基因型，沒有G1突變；其余10個綿、山羊品種均有G1突變，且都只有AA和AB兩種基因型，均沒有G1突變純合體的BB基因型。

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Detection of the G1Mutation of the GDF9Gene in Seven Sheep and Four Goat Breeds

Guligena1，Aimaiti·Maimaiti1，Chu Mingxing2，etal
（1.Institute of Animal Science，Xinjiang Academy of Animal Sciences，Urumqi830000，China; 2.Key Laboratory of Farm Animal Genetic Resources and Germplasm Innovation of Ministry of Agriculture，Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing100193，China）

Previous studies had shown that the G1mutation of the GDF9 gene had significanteffecton fecundity of some sheep breeds.Theaim of thisstudywas todetect the distribution ofG1mutation of GDF9 gene in seven sheep breeds（Small TailHan，Hu，Wadi，Dorset，Texel，Dorper，Germany Mutton Merino sheep）and four goatbreeds（Jining Grey，GuizhouWhite，Liaoning Cashmere，InnerMongolia Cashmere goat）by using PCR-RFLP.The results indicated that InnerMongolia Cashmeregoathad no theG1mutation，theother ten breeds tested had theG1mutation.

sheep;goat;fecundity;GDF9 gene;PCR-RFLP

S826.2

A

2095-3887（2015）04-0001-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.04.001

2015-04-27

新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目（2013911056）；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-IAS13）；國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項（CARS-39）

古麗格娜，女，副研究員。

儲明星，男，研究員，博士，博士生導(dǎo)師。