2-丙基-4-戊烯酸血藥濃度與谷丙轉(zhuǎn)氨酶的關(guān)系*

**通信作者 E-mail:xiejuan945@sohu.com

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-09-11網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20150911.2250.012.html

吳斯1， 謝娟1**，李龍寬2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬人民醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng)550002； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院， 貴州 都勻558000)

[摘要]目的： 研究癲癇兒童血液中丙戊酸毒性代謝產(chǎn)物2-丙基-4-戊烯酸(4-ene-VPA)血藥濃度與谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的關(guān)系。方法： 選取96例癲癇兒童作為研究對(duì)象，采用反向高效液相色譜法(RP-HLPC)法測(cè)定患兒血漿中4-ene-VPA的血藥濃度，采用常規(guī)生化檢測(cè)法檢測(cè)患兒靜脈血中ALT的含量，并進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果： 0～≤2歲組癲癇患兒血漿中4-ene-VPA血藥濃度與ALT正相關(guān)(P=0.018，r=0.621)關(guān)系。結(jié)論： 對(duì)于0～≤2歲癲癇患兒，服用丙戊酸時(shí)應(yīng)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)肝功能。

[關(guān)鍵詞]丙戊酸； 2-丙基-4-戊烯酸； 反向高效液相色譜法； 丙戊酸的代謝產(chǎn)物； 血藥濃度

[基金項(xiàng)目]*貴州省衛(wèi)生廳基金(項(xiàng)目編號(hào)：gzwkj2010-1-003)

[中圖分類(lèi)號(hào)]R917; R969.3

Correlation Analysis of Valproic Acid's Metabolites 2-propyl-

4-pentenoic in Plasma and Liver Function of Patients

WU Si1, XIE Juan2, LI Longkuan1

(1.People'sHospitalAffiliatedtoGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550002 ,Guizhou,China; 2.TheThirdAffiliated

HospitalofGuizhouMedicalUniversity,Duyun558000,Guizhou,China)

Abstract[] Objective: To explore the correlation between plasma concentration of sodium valproate's metabolites 2-propyl-4-pentenoic and ALT. Methods: A total of 96 cases of epileptic children patients who took sodium valproate medicine over 7 days and reached steady drug concentration in plasma were enrolled in this study. RP-HLPC was adopted to determine the blood concentration of 2-propyl-4-pentenoic. The ALT content in venous blood of patients was determined by conventional biochemical detection method. The correlation analysis between the blood concentration of 2-propyl-4-pentenoic and ALT content in venous blood was conducted by SPSS19.0. Results: The blood concentration of 2-propyl-4-pentenoic was positively correlated to ALT content in venous blood in 0～≤2 years old patients (P=0.018, r=0.621), but there was no significant correlation between the level of 4-ene-VPA and ALT in other age group. Conclusion： For 0～≤2 years old epileptic children patients who took sodium valproate, liver function should be monitored emphatically.

[Key words] valprioc acid; 2-propyl-4-pentenoic; reverse high-performance liquid chromatography; valproate's metabolites; plasma concentration

癲癇(epilepsy)是一種由多病因引起的慢性反復(fù)發(fā)作的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(world heALTh organization，WHO)的報(bào)告癲癇的患病率在5.0‰～11.2‰，即大約全球有5 000萬(wàn)的活動(dòng)性癲癇患者；我國(guó)的癲癇患病率為7.2‰，目前大約有900萬(wàn)的癲癇患者[1]。丙戊酸(valproic acid,VPA)是臨床廣泛使用的一線廣譜抗癲癇藥，是全面性發(fā)作及特發(fā)性全面性癲癇的首選藥，也可用于治療部分發(fā)作、繼發(fā)性全面發(fā)作及腦病性癲癇[2]。VPA臨床應(yīng)用后，陸續(xù)有引起急性致死性肝壞死的報(bào)告。VPA誘發(fā)的肝衰竭多見(jiàn)于未成年或2歲以下的嬰幼兒[3]，目前認(rèn)為VPA誘導(dǎo)的肝毒性與其自身代謝產(chǎn)物2-丙基-4-戊烯酸(2-propyl-4-pentenoic，4-ene-VPA)有關(guān)，被認(rèn)為是引起其肝毒性的物質(zhì)[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)4-ene-VPA濃度與未成年癲癇患者肝功能之間的關(guān)系進(jìn)行研究，為臨床合理用藥提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

4-ene-VPA標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%，意大利Santa Cruz Biotechnology Inc),甲醇(色譜純,美國(guó)Mreda Technologyinc Inc)，乙腈(色譜純，天津市科密歐化工，批號(hào)2013111)，三乙胺(分析純，成都市科龍化工， 辛酸(分析純，生工生物)，對(duì)溴苯乙酰溴(純度98%，阿拉丁試劑公司)，水為超純水。

1.2儀器與色譜條件

Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)，梅特勒-托利多AL204分析天平，超純水器 ，奧特賽恩AP-01P抽濾器， 江蘇康健XH-B旋渦混合器，上海理達(dá)PHS-3C pH計(jì)。色譜柱為ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為甲醇-水(75∶25)，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為256 nm，流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量20 μL。

1.3研究對(duì)象

實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論并批準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)共納入96例癲癇患者，其中男63例，女33例,平均(8.0±4.8)歲，平均體重(28.3±19.4)kg，平均身高(113±35.0)cm；單純服用VPA96例，合并服用吡拉西坦1例，合并服用卡馬西平1例，合并服用托比酯和拉莫三嗪1例，合并左乙拉西坦3例。將96例患者按照年齡分為5組，0～≤2歲組(n=14)、≥3～≤6歲組(n=30)、≥7～≤10歲組(n=22)、≥11～≤14歲(n=21)和≥15～≤17歲(n=9)。受試者納入標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)根據(jù)2001年ILAE公布的癲癇發(fā)作分類(lèi)及癲癇綜合癥分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)確診，癲癇且服用丙戊酸鈉緩釋片(杭州賽諾菲制藥有限公司，規(guī)格500 mg/30片)或丙戊酸鈉口服液(杭州賽諾菲制藥有限公司，規(guī)格12 g∶300 mL)超過(guò)7 d以上，血藥濃度達(dá)到穩(wěn)態(tài)；(2)年齡在18周歲以下，性別不限；(3)患者監(jiān)護(hù)人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)主要有:(1)未按醫(yī)囑服用藥物的患者；(2)患有消化系統(tǒng)疾病，如胃潰瘍、十二指腸潰瘍、完全或不完全腸梗阻；(3)入組前肝腎功能異常者。

1.4谷丙轉(zhuǎn)氨酸(ALT)檢測(cè)

ALT檢測(cè)采用生化常規(guī)檢測(cè)法。于患者次日服藥前抽取外周靜脈血置于抗凝管中，3 000 r/min離心5 min，取上層血漿置于EP管(1.5 mL)，-80 ℃冰箱保存，備用。

1.4.14-ene-VPA標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品精密稱(chēng)取4-ene-VPA標(biāo)準(zhǔn)品4.00 mg于10 mL的容量瓶中，加入乙腈溶液并稀釋至刻度，即400 mg/L 4-ene-VPA儲(chǔ)備液，4 ℃保存。取儲(chǔ)備液分別配制10、20、40、80、160、200 mg/L 4 -ene-VPA標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃保存。取200 μL的血漿，加4-ene-VPA標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，配制成濃度為1、2、4、8、16、20 mg/L 4-ene-VPA標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，4 ℃保存。

(1)為驗(yàn)證本論文提出的SRBM算法預(yù)測(cè)評(píng)分的準(zhǔn)確率，就硬聚類(lèi)算法(K-means聚類(lèi)算法)、隱語(yǔ)義模型(LFM)、自編碼器(autoencoder)、RBM以及SRBM算法在不同數(shù)據(jù)稀疏情況下準(zhǔn)確率進(jìn)行了分析比較。如圖8所示。

1.4.2內(nèi)標(biāo)精密稱(chēng)取正辛酸4.00 mg于10 mL容量瓶中，加入乙腈溶液并稀釋至刻度，即得400 mg/L正辛酸儲(chǔ)備液，4 ℃保存。取儲(chǔ)備液配制4 mg/L內(nèi)標(biāo)液，4 ℃保存。

1.4.3衍生化試劑精密稱(chēng)取對(duì)溴苯乙酰溴50.00 mg于5 mL容量瓶中，加入甲醇溶液并稀釋至刻度，即得10 g/L衍生化試劑，置4 ℃冰箱備用。

1.4.4血漿樣品的處理及衍生化精密吸取200 μL的血漿樣品置于1.5 mL Ep管中，加內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，渦旋20 s,加2 mol/L硫酸100 μL，渦旋20 s；加1 mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取，渦旋1 min，靜置5 min，12 000 r/min離心10 min。吸取上清液置于1.5 mL Ep管中，加入30 μL三乙胺，20 μL對(duì)溴苯乙酰溴，渦旋20 s；70 ℃水浴30 min，氮?dú)鈸]干，殘?jiān)?00 μL甲醇復(fù)溶，渦旋20 s，20 μL進(jìn)樣。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

2結(jié)果

2.1方法學(xué)考察

4-ene-VPA和內(nèi)標(biāo)正辛酸與血漿中其他組份分離良好，保留時(shí)間分別為8.92 min和13.15 min。4-ene-VPA濃度在1～20 mg/L時(shí)呈良好線性關(guān)系y=0.268 0x+0.4119(r=0.992 8)，最低定量限為1 mg/L。在低、中、高質(zhì)量濃度分別為0.061、0.004、0.016 mg/L下的回收率分別為114.5%，109.3%和97.1%。日間、日內(nèi)RSD<15%(n=5)，符合生物樣品分析要求。

2.2不同年齡組4-ene-VPA血藥濃度與ALT的關(guān)系

表1　4-ene-VPA血藥濃度與

(1)P<0.05

注：A為0～≤2歲組患者4-ene-VPA血藥濃度的范圍，B為 ≥3～≤6歲歲組患者4-ene-VPA血藥濃度的圍，C為≥7～ ≤10歲4-ene-VPA組患者血藥濃度的范圍，D為≥11～ ≤14歲4-ene-VPA組患者血藥濃度的范圍，F(xiàn)為 ≥15～≤17歲歲組患者血藥濃度的范圍 圖1　各年齡組4-ene-VPA血藥濃度的范圍 Fig.1The blood concentration of 4-ene-VPA in different age groups

3討論

研究報(bào)道證實(shí)VPA所致肝臟病變均與其自身代謝致毒有關(guān)。約97%VPA通過(guò)由肝臟代謝。在肝臟內(nèi)至少有3條途徑介導(dǎo)VPA的代謝，其中40%經(jīng)線粒體ω-氧化途徑，30%～50%經(jīng)由葡萄糖醛酸化途徑，10%～20%參與CYP450介導(dǎo)的β-氧化代謝，代謝途徑特征導(dǎo)致VPA的代謝產(chǎn)物多達(dá)50種[5-6]。4-ene-VPA是VPA經(jīng)由CYP2C9、CYP2A6及CYP2B6代謝的產(chǎn)物，其中以CYP2C9、CYP2A6為主,。研究證實(shí)4-ene-VPA是致使VPA產(chǎn)生肝毒性的物質(zhì)[7]。

4-ene-VPA在細(xì)胞內(nèi)線粒體中在短/支鏈?；?CoA脫氫酶(ACADSB)介導(dǎo)下生成4-ene-VPA-巰基輔酶A(4-ene-VPA-CoAthioester),再經(jīng)β氧化生成(E)-2,4-diene VPA-巰基輔酶A[(E)-2,4-diene VPA-CoAthioester]過(guò)程中消耗了大量谷胱甘肽(CSP)，導(dǎo)致CSP局部耗竭[8-9]。由于線粒體是依靠GSH防止脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，CSP的消耗造成了線粒體的功能障礙，導(dǎo)致肝細(xì)胞毒性。GSH是真核細(xì)胞中最豐富的巰基抗氧化劑，可與體內(nèi)生成的氧化產(chǎn)物反應(yīng)，從而減弱氧化應(yīng)激；同時(shí)游離的輔酶A(CoA)在此過(guò)程中被惡意性消耗，造成CoA缺乏，使得內(nèi)源性脂肪酸CoA依賴(lài)型氧化代謝反應(yīng)受阻，能量生成障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。有研究指出4-ene-VPA濃度與VPA的濃度呈非線性關(guān)系[10]，因此有必要建立一種簡(jiǎn)單快速的分析方法來(lái)對(duì)4-ene-VPA濃度進(jìn)行分析。

本次研究發(fā)現(xiàn)0～≤2歲癲癇患兒的4-ene-VPA濃度與ALT(P=0.018，r=0.521)顯著相關(guān)，說(shuō)明在特定范圍內(nèi)C4-ene-VPA對(duì)患者肝功能是有指導(dǎo)意義的。ALT是臨床常用的檢測(cè)肝細(xì)胞損傷的指標(biāo)，當(dāng)肝細(xì)胞膜受損或細(xì)胞壞死時(shí)，ALT進(jìn)入血清便增多，通過(guò)測(cè)定血清或血漿ALT的活性，即可反映肝細(xì)胞受損情況及損傷程度。因此可以得出2歲以下的兒童是VPA誘發(fā)的肝衰竭的危險(xiǎn)人群。這與全美關(guān)于VPA致死性肝毒性病例資料調(diào)查回顧性得出的結(jié)論一致[11]，這可能是因?yàn)閶胗變簳r(shí)期代謝酶的種類(lèi)及功能尚未發(fā)育完全。0～≤2歲的癲癇患兒作為肝損傷的高危人群，4-ene-VPA血藥濃度對(duì)其傷害程度較大，4-ene-VPA血藥濃度與ALT正相關(guān)的，所以對(duì)于2歲以下嬰幼兒，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注肝功能的變化，及時(shí)調(diào)整給藥方案。

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(2015-04-20收稿，2015-08-01修回)

中文編輯： 文箐潁； 英文編輯： 劉華