邱洋洋，童國(guó)林*

耐熱性木聚糖酶預(yù)處理麥草原料及麥草漿的比較研究

邱洋洋，童國(guó)林*

（南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省制漿造紙科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210037）

研究了耐熱性木聚糖酶預(yù)處理麥草原料的工藝，并對(duì)酶處理麥草原料與堿法麥草漿酶處理的效果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明：麥草木聚糖酶預(yù)處理適宜條件為酶用量40 IU/g、液比1∶9、pH值7.2、時(shí)間4 h、溫度95℃。該木聚糖酶能夠在中性及相對(duì)較高溫環(huán)境下具有較好的酶學(xué)穩(wěn)定性。對(duì)比麥草原料及漿料的木聚糖酶預(yù)處理效果表明：麥草原料經(jīng)木聚糖酶處理后酶解液中還原糖含量為1.14%，而麥草漿酶處理后酶解液的還原糖含量為1.23%；經(jīng)堿抽提后麥草原料還原糖溶解量增加了0.39%，而漿料則增加1.25%。說(shuō)明木聚糖酶對(duì)麥草漿降解半纖維素作用明顯優(yōu)于對(duì)麥草原料的作用，且堿抽提提高了酶處理的效果。

耐熱性木聚糖酶；麥草；麥草漿；預(yù)處理；還原糖

我國(guó)造紙工業(yè)發(fā)展所面臨的主要問(wèn)題是原料供求矛盾突出和節(jié)能減排任務(wù)艱巨。造紙工業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃指出要以科學(xué)合理利用非木材資源，實(shí)施清潔生產(chǎn)新工藝為出發(fā)點(diǎn)，進(jìn)而提高產(chǎn)業(yè)節(jié)能減排和綜合利用水平，提高非木纖維制漿造紙質(zhì)量，以緩解國(guó)內(nèi)纖維資源供需矛盾和對(duì)進(jìn)口木材纖維和廢紙的依賴程度，達(dá)到優(yōu)化造紙?jiān)辖Y(jié)構(gòu)的目的[1]。國(guó)家明確提出要用生物技術(shù)改造傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，“十二五”期間，撥出專項(xiàng)資金支持在制漿造紙領(lǐng)域應(yīng)用生物技術(shù)[2]，因此本文就耐熱性木聚糖酶預(yù)處理麥草秸稈原料和麥草漿進(jìn)行研究，為耐熱型木聚糖酶應(yīng)用于麥草秸稈等非木材纖維原料制漿提供理論支持。

木聚糖酶是常被用于進(jìn)行漿料處理的半纖維素酶，是由D-木糖以β-1,4糖苷鍵連接而成的主鏈和由種類各異的糖基側(cè)鏈組成的側(cè)鏈構(gòu)成[3]。其中以內(nèi)切-1,4-β-D木聚糖酶為主，是對(duì)木聚糖降解起關(guān)鍵作用的木聚糖降解酶[4]。目前絕大多數(shù)商用木聚糖酶來(lái)源于霉菌，其有酶產(chǎn)量相對(duì)較高的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、作用條件偏中性等缺點(diǎn)，在造紙、飼料和食品等工業(yè)的極端環(huán)境下應(yīng)用受到一定限制[5]。經(jīng)過(guò)近年來(lái)的不斷研究，科研工作者發(fā)現(xiàn)了一些可以在耐極端條件下發(fā)揮作用的細(xì)菌木聚糖酶，具有較好的開(kāi)發(fā)前景[6]。已報(bào)道的用于生產(chǎn)木聚糖酶的細(xì)菌以芽孢桿菌居多。Anand A等[7]研究了從印度高溫堆肥中篩選出的一株嗜熱脫氮芽孢桿菌所產(chǎn)的木聚糖酶，其作用的最適溫度為70℃。鄭宏臣等[8]分析了從造紙廠周邊土壤中分離純化出來(lái)的一株產(chǎn)堿性木聚糖酶的短小芽孢桿菌所產(chǎn)的木聚糖酶，其最適反應(yīng)pH值可達(dá)8.0，最適反應(yīng)溫度為55℃；陳學(xué)敏等[9]在云南騰沖熱泉中分離得到產(chǎn)木聚糖酶的菌株，經(jīng)鑒定為地芽孢桿菌，研究發(fā)現(xiàn)其所產(chǎn)木聚糖酶的最適pH值和最適溫度分別為7.0和70℃；梁方方等[10]在堆放青貯飼料的土壤中分離出一株枯草芽孢桿菌X7，在對(duì)其所產(chǎn)出的酶進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)該酶最適pH值和溫度分別為6.0和50℃。

本文選用的耐熱耐堿木聚糖酶，來(lái)源于極端嗜熱菌海棲熱胞菌（Thermotoga maritime），通過(guò)海棲熱胞菌的XynB基因克隆到熱激表達(dá)載體pHsh中，得到了耐熱性木聚糖酶[11]。對(duì)該木聚糖酶用于麥草預(yù)處理工藝條件進(jìn)行優(yōu)選，并就麥草原料及麥草漿料在相同處理?xiàng)l件下處理效果進(jìn)行比較，從而為其后續(xù)開(kāi)發(fā)應(yīng)用研究提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

1.1.1 原料

麥草由甘肅某造紙廠提供，實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行篩選，切片后水洗，風(fēng)干儲(chǔ)存平衡水分后測(cè)水分。

自制麥草漿：麥草在YYG3-10-1.25油浴蒸煮器內(nèi)采用燒堿-AQ蒸煮工藝制得麥草漿，卡伯值14.7。

1.1.2 木聚糖酶

耐熱性木聚糖酶（pHsh-XynB）的酶活為3 000 IU/mL，由南京師范大學(xué)生命科學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 耐熱性木聚糖酶酶活的測(cè)定方法

耐熱性木聚糖酶活性的測(cè)定[12]，以0.5%樺樹(shù)木聚糖作為底物，利用對(duì)羥基苯甲酸酰肼與還原糖的顯色反應(yīng)進(jìn)行比色，具體方法：在90 μL（25 mM pH 6.3）的磷酸鈉緩沖液中加0.1 mL 1%樺樹(shù)木聚糖，然后添加10 μL稀釋的酶液于95℃下反應(yīng)10 min，最后加入600 μL終止劑/顯色劑PAHBAH（配方為：0.5 M NaOH 和溶于0.5 M HCl的5% PAHBAH體積比4∶1混合）終止反應(yīng)。其混合物在沸水浴中加熱10 min后，立即在冰水浴中冷卻，使用分光光度計(jì)，在410 nm下測(cè)其吸收值。木聚糖酶1個(gè)活性單位定義為每分鐘催化產(chǎn)生1 μmol木糖的酶量。

1.2.2 麥草及漿料的酶處理

將清洗風(fēng)干后原料、25 mM檸檬酸鈉緩沖液（pH值分別為5.2、5.7、6.2、6.7、7.2、7.7和8.2）、酶液在聚乙烯塑料袋中充分混合后，置于恒溫水浴鍋中加熱，每隔20 min揉搓一次，使原料與酶液充分混合，反應(yīng)到規(guī)定時(shí)間取出。用布袋將酶解液分離出來(lái)用于分析，所得原料用水洗干凈，存放在塑料袋中平衡水分，測(cè)水分后用于后續(xù)的處理及檢測(cè)。對(duì)照樣處理?xiàng)l件與酶處理?xiàng)l件相同，但不加酶處理[13]。

1.2.3 麥草原料的堿處理

麥草在經(jīng)過(guò)酶處理洗干凈后置于聚乙烯塑料袋中，用氫氧化鈉對(duì)麥草進(jìn)行抽提處理。處理?xiàng)l件：液比1∶10，時(shí)間1 h，溫度70℃，堿用量2%[14]。

1.2.4 處理液還原糖的測(cè)定

酶解液的還原糖采用DNS方法測(cè)定[15]。

1.2.5 處理液吸光度的測(cè)定

木質(zhì)素在280 nm附近具有吸收峰。吸光度可作為一個(gè)相對(duì)量，間接反映木質(zhì)素溶出情況。在酶解液中滴入幾滴CCl3COOH，然后調(diào)節(jié)pH值到9.0，離心后取上層清液，稀釋到一定倍數(shù)，在UV-751型分光光度計(jì)280 nm處測(cè)定吸光度。吸光度值可間接反映木質(zhì)素溶出量[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐熱性木聚糖酶預(yù)處理工藝條件的選擇

在對(duì)麥草進(jìn)行酶預(yù)處理時(shí)，必須在其最優(yōu)條件下進(jìn)行處理。木聚糖酶是具有生物活性的大分子，在不同環(huán)境下，所表現(xiàn)出來(lái)的效果有所差異。預(yù)處理的過(guò)程中需綜合考慮酶用量、液比、pH值、處理時(shí)間以及處理溫度對(duì)木聚糖酶預(yù)處理麥草過(guò)程中的影響。在耐熱性木聚糖酶預(yù)處理麥草原料研究中，以測(cè)定處理液中還原糖的含量、木質(zhì)素含量和處理后稻草的得率來(lái)評(píng)價(jià)預(yù)處理效果。

2.1.1 木聚糖酶用量對(duì)麥草預(yù)處理的影響

酶用量對(duì)酶處理效果是個(gè)關(guān)鍵因素，酶用量越高，則溶出還原糖越多，木質(zhì)素溶出量也越多，得率越低。如圖 1 所示，隨著酶用量不斷的增加，溶出的還原糖含量和吸光值也逐漸增大，酶處理后麥草得率隨酶用量不斷增加而減小，在酶用量為60 IU/g時(shí)，得率有小幅上升，這可能與溶出的還原糖“回吸”有關(guān)[15]。在酶用量為40 IU/g時(shí)還原糖的含量升到較大值1.07%，木質(zhì)素的吸光值為0.497，得率為90.35%。當(dāng)酶用量為60 IU/g時(shí)還原糖含量和木質(zhì)素吸光值都較大，而此時(shí)麥草得率卻下降較多。綜合考慮酶的生產(chǎn)成本，酶用量為40 IU/g時(shí)較為合適酶用量。

2.1.2 液比對(duì)木聚糖酶預(yù)處理的影響

由于酶處理液濃度影響酶反應(yīng)速度，預(yù)處理液中酶的濃度則是由液比大小決定。液比越大，酶處理液濃度越小，酶的反應(yīng)速度相對(duì)較慢；液比小，則酶處理液濃度大，但又不能使酶處理液與麥草充分均勻混合。因此，選擇合適的液比就顯得十分重要，既能保證一定的酶處理液濃度，又能使酶處理液與麥草充分均勻的混合，結(jié)果如圖2所示。由圖 2 可以知，隨著液比逐漸增大，酶解液中還原糖含量先上升后下降，吸光值也是呈現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，酶處理后麥草得率變化趨勢(shì)同還原糖以及吸光值變化趨勢(shì)相似，液比為1∶9時(shí)得率在90%左右，還原糖含量為1.07%，吸光值為0.639。

圖2 液比對(duì)木聚糖酶預(yù)處理的影響

2.1.3 pH值對(duì)木聚糖酶預(yù)處理的影響

酶的活性會(huì)受到其所處反應(yīng)環(huán)境的影響，pH過(guò)高或者過(guò)低都會(huì)影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象，甚至使酶不能正常發(fā)揮功能，木聚糖酶反應(yīng)的pH值對(duì)麥草木聚糖酶預(yù)處理效果有很大的影響。針對(duì)本文所用木聚糖酶酶活特性，pH 值在5.2～8.2范圍進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，隨著pH值不斷增大，處理液中還原糖含量和吸光值均先增加后下降，得率隨著pH值增大而先減小后上升。反映出緩沖液的酸堿強(qiáng)度大小對(duì)酶的活性有較大的影響。當(dāng)pH為7.2時(shí)，還原糖含量為1.15%，吸光值為0.711。此時(shí)吸光值較大，表明隨木聚糖溶出木質(zhì)素量較大。雖然此時(shí)還原糖含量不是最大，但考慮到脫木質(zhì)素的能力及處理后得率，綜上各個(gè)因素，pH值在7.2左右接近中性范圍，較為合適。

圖3 pH值對(duì)木聚糖酶預(yù)處理的影響

2.1.4 時(shí)間對(duì)木聚糖酶預(yù)處理的影響

該木聚糖酶具有較好的穩(wěn)定性，在95℃下半衰期為2 h，但不同底物對(duì)酶的性質(zhì)有不同影響，因此木聚糖酶預(yù)處理的時(shí)間也十分重要。由圖4可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間由3 h延長(zhǎng)至4 h還原糖含量和吸光值均隨之增加，反應(yīng)時(shí)間由4 h延長(zhǎng)至6 h吸光值變化較小，此時(shí)還原糖含量變化也不大，說(shuō)明酶解反應(yīng)在前4 h相對(duì)較快，隨著時(shí)間增加對(duì)預(yù)處理的影響越來(lái)越小。從圖中可知，隨著時(shí)間的推移，還原糖含量又有所增加，可能原因是原料表面木聚糖溶出而形成空隙增加，從而為原料內(nèi)部木聚糖的溶出創(chuàng)造條件。因此酶處理的反應(yīng)時(shí)間選擇4 h。

圖4 時(shí)間對(duì)木聚糖酶預(yù)處理的影響

2.1.5 溫度對(duì)木聚糖酶預(yù)處理的影響

木聚糖酶在不同的溫度條件下，其反應(yīng)速率不同，溫度對(duì)酶的影響主要有兩方面，一方面是當(dāng)溫度升高時(shí)，酶的反映速率加快；另一方面，隨著溫度的升高，酶的穩(wěn)定性逐漸降低，反應(yīng)時(shí)間逐漸縮短，反應(yīng)效果降低。酶促反應(yīng)的最適溫度是這兩種過(guò)程平衡的結(jié)果。針對(duì)所選用的木聚糖酶對(duì)溫度具有較高的適應(yīng)能力及較寬的適應(yīng)范圍，選擇在80～100℃范圍進(jìn)行優(yōu)化。

圖5 溫度對(duì)木聚糖酶預(yù)處理的影響

由圖5可知，隨著溫度的增大，還原糖含量和吸光值均先增大后逐漸減小。還原糖含量在90℃時(shí)達(dá)到最大值1.16%，然后不斷減小，而吸光值在95℃達(dá)到最大值0.710，此時(shí)還原糖含量為1.15%。溫度在高于95℃后，酶蛋白的活性開(kāi)始降低，還原糖含量開(kāi)始下降。因此，溫度選擇95℃。

綜合以上對(duì)木聚糖酶預(yù)處理麥草的研究，木聚糖酶預(yù)處理麥草原料適宜工藝條件為：酶用量40 IU/g，液比：1∶9，pH值7.2，溫度95℃，處理時(shí)間4 h。

2.2 耐熱性木聚糖酶處理麥草原料與麥草漿效果的比較

2.2.1 麥草原料及麥草漿木聚糖酶處理效果的對(duì)比

在酶處理麥草原料過(guò)程中，由于麥草表面含有一層致密層，使得進(jìn)行酶處理的過(guò)程酶與半纖維素接觸相對(duì)困難，而麥草經(jīng)蒸煮后，可以消除其影響，為探索酶處理麥草與麥草漿的效果差異，比較兩者作用效果，以酶解液中還原糖含量和木質(zhì)素含量來(lái)表示，結(jié)果如表1所示。由表1結(jié)果可知，麥草和麥草漿經(jīng)過(guò)木聚糖酶處理后均有降解半纖維素和脫除木質(zhì)素的作用。麥草原料在經(jīng)木聚糖酶處理后酶解液中的原糖含量為1.14%，相對(duì)應(yīng)麥草漿酶處理的還原糖含量為1.23%，反映出木聚糖酶對(duì)麥草漿降解半纖維素作用明顯優(yōu)于對(duì)麥草原料的作用，這是因?yàn)闈{料的比表面積比麥草原料的比表面積大，木聚糖酶在漿料上的吸附性比原料的吸附性好，酶與木聚糖作用的可及度存在明顯差異。麥草酶解液中木質(zhì)素含量為0.35 g/L，而麥草漿酶解液中木質(zhì)素含量為0.10 g/L，在蒸煮過(guò)程中已有大量的木質(zhì)素溶出，原料中木質(zhì)素含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于漿料中木質(zhì)素含量。

表1 麥草和麥草漿酶處理液的分析

2.2.2 木聚糖酶處理麥草及麥草漿后堿抽提效果的對(duì)比

對(duì)經(jīng)過(guò)酶處理的麥草和漿料進(jìn)行堿抽提，堿抽提時(shí)用堿量為2%，通過(guò)對(duì)比有酶處理和無(wú)酶處理原料和漿料堿抽提后的效果如表2所示。

表2 麥草和麥草漿酶處理后堿抽提效果的比較

麥草的酶解液中還原糖含量由堿抽提的0.97%增加到酶處理后堿抽提的1.36%。而漿料則由0.08%增加到1.33%。麥草堿抽提后的木質(zhì)素含量由0.56 g/L增加到0.70 g/L，漿料經(jīng)過(guò)堿抽提的木質(zhì)素含量也從0.17 g/L增加到0.25 g/L。不論麥草還是麥草漿，經(jīng)過(guò)酶處理比沒(méi)經(jīng)過(guò)酶處理的堿抽提效果更好。

3 結(jié)論

1）通過(guò)對(duì)木聚糖酶預(yù)處理麥草的研究，木聚糖酶預(yù)處理最適條件：酶用量40 IU/g、液比1∶9、pH值7.2、時(shí)間4 h、溫度95℃。且該木聚糖酶能在偏中性及高溫的環(huán)境下具有較好的酶學(xué)穩(wěn)定性，可適應(yīng)于預(yù)處理階段較高溫環(huán)境。

2）在此處理?xiàng)l件下，麥草原料和麥草漿的酶處理效果顯示：麥草漿中木聚糖在木聚糖酶處理下更容易溶出，具有更好的反應(yīng)性能。麥草原料由于其表面結(jié)構(gòu)影響反應(yīng)性能相對(duì)較差。酶處理后進(jìn)行適當(dāng)?shù)膲A處理可以提高木質(zhì)素和木聚糖的溶出效果。

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Comparison of Wheat Straw and Straw Pulp with Thermostable Xylanase Preteatments

QIU Yang-yang, TONG Guo-lin*
（Nanjing Forestry University, Jiangsu Provincial Key Laboratory of Pulp and Papermaking Science, Nanjing 210037, China）

It was investigated that thermostable xylanase was used for the pretreatment if the raw material of wheat straw, and compared with treatment of wheat straw pulp. It was found that the suitable pretreatment condition of thermostable xylanase process was as following, the xylanase charge was 40 IU/g, liquor ratio was 1∶9, pH was 7.2, reaction time was 4h and temperature was 95℃ respectively. The result was shown that thermostable xylanase was very stable under neutral and high temperature conditions. Morever under the pretreatment condition, the thermostable xylanase could give good pretreatment ability as compared with wheat straw pulp, and helped to improve the effect of alkali extraction after pretreatment.

thermostable xylanase; wheat straw; wheat straw pulp; pretreatment; reducing sugar

TS74

A

1004-8405(2015)02-0027-07

2015-01-27

基金課題：江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目。

邱洋洋（1987～），男，碩士研究生；研究方向：制漿化學(xué)及生物制漿技術(shù)。

* 通訊作者：童國(guó)林，教授，博士生導(dǎo)師；研究方向：制漿化學(xué)、廢紙?jiān)偕?、纖維素改性等。gtong@njfu.edu.cn