孫 勇，付世杰，秦保亮，王亞楠，王自良（河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

銅離子鰲合物人工抗原的合成與鑒定

孫 勇，付世杰，秦保亮，王亞楠，王自良★
（河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

該研究為獲得銅離子螯合物人工抗原，采用異硫氰酯法，以異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸(ITCBE)為雙功能螯合劑，將載體蛋白牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）分別與Cu2+偶聯(lián)，得到人工抗原(Cu2+-ITCBE-BSA)和包被原（Cu2+-ITCBE-OVA）。通過紫外分光光度法(UV)和電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(ICP-AES)，以及變性聚丙烯凝膠電泳（SDS-PAGE）和免疫學(xué)檢測（Immunoassay）的方法對所獲得的免疫原進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示獲得人工抗原的濃度為9.21 mg/mL；Cu2+的含量為16.83 g/mL；免疫小鼠間接ELISA效價達(dá)1∶51 200以上，阻斷ELISA檢測Cu2+-EDTA的半數(shù)抑制濃度（IC50）為36.73 ng/mL，為抗銅離子單克隆抗體（mAb）的進(jìn)一步研制奠定了基礎(chǔ)。

銅離子；抗原合成；鑒定

隨著城市化進(jìn)程的不斷加快和工業(yè)化水平的迅速提升，對重金屬銅的應(yīng)用越來越廣泛，然而由于生產(chǎn)、生活所致的銅污染也日趨加重，通過食物鏈的富集對人和動物產(chǎn)生了極大的危害[1]。雖然銅是人和動物生命活動中許多重要酶的組成部分，但是過量的銅可引起急性或慢性中毒，并對一些水生動物有致死性威脅[2-3]。因此，定期監(jiān)測食品及環(huán)境中銅的含量對保持人類健康和減少水產(chǎn)養(yǎng)殖損失具有重要意義。檢測銅離子的傳統(tǒng)方法多為物理化學(xué)儀器檢測法，如原子吸收光譜分析法（AAS）、電感耦合等離子發(fā)射光譜法（ICP-AES）、原子熒光法（AFS）、紫外可見分光光度法（UV）、陽極溶出伏安法（ASV）和X射線熒光光譜法（XRF）等[4]，這些檢測方法雖然靈敏度高，精確性好，但是所需儀器價格昂貴并且需要專業(yè)培訓(xùn)，往往僅限于實驗室人員操作而不適合大范圍普及。而免疫學(xué)檢測方法則有著快速、簡便、特異、敏感、價格低廉的優(yōu)點。因此，本研究旨在獲得銅離子螯合物人工抗原，為抗銅離子單克隆抗體（mAb）的進(jìn)一步研制奠定基礎(chǔ)。

1.1 主要材料異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸（ITCBE），購自上海同仁化學(xué)研究所；HEPES、BSA、OVA、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、TMB、TEMED、SDS、巰基乙醇，均購自Sigma公司；透析袋、考馬斯亮藍(lán)R-250、丙烯酰胺、N,N-甲叉雙丙烯酰胺、TRIS、過硫酸銨、甘氨酸，均購自北京索萊寶科技有限公司；羊抗鼠酶標(biāo)二抗（GaMIgG-HRP），購于上海華美生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 人工抗原的合成 采用異硫氰酯法[5]，稱取5 mg ITCBE溶于0.5 mL二甲基亞砜（DMSO）中形成鰲合劑溶液；稱取8.5 mg CuSO4·5H2O溶于200 μL pH 7.0的HEPES緩沖液（10 mm/L）中形成Cu2+溶液。將鰲合劑溶液逐滴加入Cu2+溶液中，室溫條件下?lián)u床反應(yīng)12 h，獲得Cu2+-ITCBE鰲合物半抗原。稱取20 mg BSA溶于1 mL HEPES緩沖液中形成20 mg/mL的載體蛋白溶液。將1 mL載體蛋白溶液逐滴加入Cu2+-ITCBE鰲合物半抗原溶液中，邊滴加邊攪拌，并用NaOH調(diào)節(jié)pH至9.0，室溫條件下?lián)u床反應(yīng)24 h，然后移入透析袋中透析12 d，即獲得Cu2+-ITCBE-BSA完全抗原[6-8]。人工包被原Cu2+-ITCBE-OVA的合成方法同于人工免疫原的合成方法。

1.2.2 人工抗原的鑒定

1.2.2.1 人工抗原的濃度測定 以0.01 M pH 7.4的PBS緩沖液做為空白對照，1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)BSA溶液做為陽性對照，用微量蛋白核酸測定儀在280 nm波長下測定人工抗原中的蛋白濃度。

1.2.2.2 ICP-AES檢測人工抗原中Cu2+的濃度 以PBS緩沖液做為空白對照，將免疫原Cu2+-ITCBE-BSA用PBS緩沖液稀釋50倍，用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀測定人工抗原中Cu2+的含量[9]。

1.2.2.3 人工抗原紫外光譜（UV）鑒定 以PBS緩沖液做為空白對照，1 mg/mL BSA溶液、1 mg/mL ITCBE-BSA溶液為陽性對照，并將免疫原Cu2+-ITCBE-BSA用PBS緩沖液稀釋成1 mg/mL。在波長220～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描[10]。

1 材料與方法

1.2.2.4 人工抗原SDS-PAGE鑒定 根據(jù)BSA的分子量（6.62×104），選擇5%濃縮膠，12%分離膠，濃縮膠電壓為40 V，分離膠電壓為60 V，點樣量10 μg/孔，對BSA、Cu2+-ITCBE-BSA進(jìn)行垂直SDS-PAGE電泳鑒定[11]。

1.2.2.5 多抗血清（pAb）免疫學(xué)鑒定 選取6～8周齡雌性Balb/C小鼠5只，采用背部皮下4點注射法進(jìn)行免疫，免疫劑量為60 μg/只。免疫5次，每次間隔3周。最后1次免疫后10 d斷尾采血，3 000 r/min離心5 min，收集血清備用。

1.2.2.5.1 效價測定 采用間接ELISA法測定pAb效價：將2 μg/mL Cu2+-ITCBE-OVA包板，50 μL/孔，4℃過夜；PBST洗板3次，用5%豬血清封閉，200 μL/孔，37℃孵育1 h；洗滌3次，從第一孔加pAb，用封閉液倍比稀釋，50 μL/孔，設(shè)陰性對照（NC）和空白對照（BC），37℃孵育15 min；洗滌3次，每次間隔3 min，加HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1:1 000），50 μL/孔，37℃孵育30 min；洗滌5次，每次間隔3 min，加酶底物TMB顯色，50 μL/孔，室溫避光反應(yīng)5 min；加入2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，50 μL/孔。測定各孔A450nm值，以待測孔A450nm≥NCA450nm的2.1倍（P/N≥2.1），判為陽性孔[12]。

1.2.2.5.2 敏感性鑒定 采用阻斷ELISA法鑒定pAb敏感性：從第一孔加1 000 ng/mL的Cu2+-EDTA標(biāo)準(zhǔn)液，倍比稀釋至倒數(shù)第二孔，50 μL/孔，最后一孔做陽性對照；加A450nm為1.0的pAb 50 μL/孔，設(shè)NC和BC，37℃孵育15 min；洗滌3次，每次間隔3 min，加酶標(biāo)二抗，50 μL/孔，37℃孵育30 min；洗滌5次，每次間隔3 min，加酶底物TMB顯色，50 μL/孔，室溫避光反應(yīng)5 min；加入終止液終止反應(yīng)，50 μL/孔。測定各孔A450nm值，計算抑制率（B/ B0%，B0為Cu2+-EDTA 0濃度時的吸光值，B為Cu2+-EDTA不同濃度時的吸光值）。以B/B0%為縱坐標(biāo)，不同濃度抑制劑的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制Cu2+-EDTA對Cu2+-EDTA pAb的抑制曲線，根據(jù)曲線趨勢推導(dǎo)回歸方程，計算pAb對Cu2+-EDTA的50%抑制濃度（IC50），并以IC50作為敏感度[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分光光度法測定抗原濃度結(jié)果利用Pharmacia蛋白質(zhì)核酸分析儀在280 nm波長下測定抗原Cu2+-ITCBE-BSA的蛋白濃度為9.21 mg/mL。

2

2.2 ICPP--AAEESS測定抗原中CCuu22++含量結(jié)果稀釋50倍后的樣品讀數(shù)結(jié)果見表1。由表1中數(shù)據(jù)計算可知，Cu2+-ITCBE-BSA和Cu2+-ITCBE-OVA中Cu2+的含量分別為16.83 μg/mL、6.42 μg/mL。

表1 ICP-AES測定樣品中Cu2+含量Table1 The Cu2+concentration in sample assay with ICP-AES

2.3 紫外掃描載體蛋白和人工抗原圖譜由圖1可知，BSA在277 nm處出現(xiàn)最大吸收峰；ITCBE-BSA在274 nm處出現(xiàn)最大吸收峰；Cu2+-ITCBE-BSA在271 nm處出現(xiàn)吸收峰。峰值的改變證明了人工抗原合成成功。

圖1 BSA及人工抗原的紫外光譜圖Fig.1 The UV spectra of BSA and artificial antigen

2.4 人工抗原SDS--PPAAGGEE電泳鑒定結(jié)果圖2結(jié)果顯示，人工抗原Cu2+-ITCBE-BSA相對于BSA，分子量有所增加。說明BSA與Cu2+-ITCBE偶聯(lián)成功。

2.5 多抗血清的免疫學(xué)鑒定結(jié)果

2.5.1 間接ELISA效價測定 結(jié)果見表2。由表2可知，免疫的5只小鼠血清抗體效價均達(dá)到了10-4，說明獲得了較好的免疫效果。

2.5.2 Cu2+-EDTA pAb敏感性鑒定 表3顯示，5只小鼠的抗血清均產(chǎn)生了抑制，其中3號小鼠的抑制效果最好。由圖3可知，3號小鼠的線性回歸方程為y＝-37.529x+108.74，R2為0.9512，IC50為36.73 ng/mL。

3 結(jié)論與討論

Cu2+結(jié)構(gòu)簡單，無免疫原性，且?guī)в须姾?，能與機體內(nèi)生物分子發(fā)生不可逆反應(yīng)而導(dǎo)致機體中毒。因此必須通過螯合劑將Cu2+連接到載體蛋白上制備人工抗原。目前，常用的大分子雙功能鰲合劑主要包括EDTA及其衍生物和DTPA及其衍生物[14]。本試驗選擇異硫氰酸芐基乙二胺四乙酸（ITCBE）作為雙功能鰲合劑，Cu2+與ITCBE螯合后形成一個穩(wěn)定的六齒狀的配位化合物，與載體蛋白結(jié)合后能產(chǎn)生很好的免疫原性[15]。

關(guān)于Cu2+與雙功能螯合劑ITCBE合成半抗原的反應(yīng)條件關(guān)系到人工抗原的結(jié)合比。ITCBE在弱堿環(huán)境下能更好的螯合金屬離子，而Cu2+在堿性條件下生成氫氧化銅沉淀。本試驗采用pH=7.0的反應(yīng)條件使Cu2+與ITCBE螯合，取得了較好的效果，是否還有更好的反應(yīng)條件仍需進(jìn)一步研究。

圖2 免疫原Cu2+-ITCBE-BSA的SDS-PAGE鑒定Fig.2 Identification of Cu2+-ITCBE-BSA conjugation by SDS-PAGE

表2 小鼠抗Cu2+-ITCBE血清效價Table2 ELISA titers of antiserum against Cu2+-EDTA

表3 小鼠抗血清對Cu2+-EDTA的抑制效價Table3 Inhibitive titers of antiserum against Cu2+-EDTA

圖3 小鼠多抗血清對Cu2+-EDTA的阻斷ELISA抑制曲線Fig.3 The inhibitive curve for mouse 3 pAb to Cu2+-EDTA by blocking ELISA

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Synthesis and Identification of Artificial Antigen Against Copper Ionic Chelate

Sun Yong,Fu Shijie,Qin Baoliang,Wang Yanan,Wang Ziliang*
(Henan Institute of Science and Technology,Henan Xinxiang 453003)

To obtain the artificial immunogen against copper ionic chelate.Copper ion[Cu(II)] was coupled to bovine serum albumin(BSA)and ovalbumin(OVA)which were carrier proteins via a bifunctional chelating agent Isothiocyanobenzyl-EDTA(ITCBE).The immunogen was identified by ultraviolet spectrophotometry(UV),inductively coupled plasma atomic emission spectrometry(ICPAES),denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), andimmunoassay.Theresults showed that the concentration of artificial antigen and Cu2+were 9.21 mg/mL and 16.83 μg/mL.The Cu2+-EDTA pAb of mouses had the titers of 1:51200 by indirect ELISA and the IC50 of Cu2+-EDTA is 36.73 ng/mL by blocking ELISA.The artificial antigen was successfully prepared and has a good immunogenicity,which provided foundations for the development of mAb against copper ions.

Copper ions;Antigen synthesis;Identification

R392.1

B

1672-9692(2015)12-0012-05

2015-11-10

孫勇（1990-），男，碩士，研究方向為動物性食品安全免疫檢測。

王自良（1966-），男，博士，教授，研究方向為動物性食品安全免疫檢測。

國家“十二五”科技支撐計劃重大專項“重金屬離子抗體的制備及其產(chǎn)品研發(fā) ”（2011BAK10B01-15）