程樹穎，關(guān)維元，徐永星，劉保東，關(guān) 旸*

（1. 哈爾濱師范大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150025；2. 浙江省建德市林業(yè)科學(xué)研究所，浙江 建德 311600）

三種極危水韭孢子體發(fā)育及其生理特征

程樹穎1，關(guān)維元2，徐永星2，劉保東1，關(guān) 旸1*

（1. 哈爾濱師范大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150025；2. 浙江省建德市林業(yè)科學(xué)研究所，浙江 建德 311600）

以人工繁殖的極度瀕危植物中華水韭（Isoetes sinensis）、東方水韭（I. orientalis）、云貴水韭（I. yunguiensis）為試驗材料，測定了三種水韭生長過程中光合參數(shù)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及呼吸速率等生理指標(biāo)，探討了不同生長時期三種水韭的生理變化。結(jié)果顯示：三種水韭可溶性糖及可溶性蛋白含量在營養(yǎng)生長期有小幅下降，其后有所升高；葉綠素含量在營養(yǎng)生長期上升而過渡生長期上升緩慢趨于平緩，之后又逐漸上升；三種水韭光合參數(shù)均呈先升高再下降又升高的趨勢；三種水韭在營養(yǎng)生長期凈光合速率上升不顯著，呼吸速率變化顯著，氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率減小。

水韭；孢子體發(fā)育；生理特征

水韭屬（Isoetes）植物是水韭科（Isoetaceae）的孑遺屬，為沼生挺水的原始蕨類植物[1]。廣泛分布在北半球，僅少數(shù)幾個種類零星的分布于熱帶[2]，生境從水生到陸生，具有特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)、脆弱敏感的生態(tài)適應(yīng)能力以及景天酸代謝這一旱生植物才有的特殊代謝途徑[3]。

目前分布在我國的水韭科植物的種群數(shù)量日趨減少僅有5種：中華水韭（Isoetes sinensis）、東方水韭（I. orientalis）、云貴水韭（I. yunguiensis）、高寒水韭（I . hypsophila）臺灣水韭（I . taiwanensis）[4～5]。本文報道了均已被列為國家一級重點保護珍稀瀕危蕨類中華水韭、東方水韭和云貴水韭[6～7]。前兩者分布在低海拔的污染相對嚴(yán)重的長江中下游，后者分布在中海拔的污染相對較輕的云貴高原[8]。其中東方水韭曾被誤認為是中華水韭，但前者是六倍體，后者是四倍體[9]；云貴水韭曾被誤認為是寬葉水韭（I. japonica），2002年王青鋒等依據(jù)其孢子形態(tài)、染色體數(shù)目等主要特征，將其命名為水韭屬植物的一個新種[10]。國際上對水韭屬植物已做過一些有關(guān)細胞學(xué)及孢子形態(tài)學(xué)等方面的研究工作，如U. Kristen等對水韭葉舌的結(jié)構(gòu)功能做了大量的研究[11]，George等探索了個別種的起源與分布[12]，Johna Raven等報道了水韭伴生種谷精草的CO2和CAM的生理作用機制[13]，劉婷婷等[14]和孫昊等[15]先后報道了中華水韭在低溫、除草劑等逆境條件下其抗氧化酶系統(tǒng)、光合參數(shù)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等生理生態(tài)變化，二者均認為水韭在逆境下所表現(xiàn)的生理生態(tài)與其他種子植物不同，并試圖從逆境生理上解釋水韭瀕危的原因。但二者結(jié)論均是就成熟植株得出的且僅限于中華水韭，但對三種水韭孢子體生長過程中的生理特征研究迄今尚未見報道。

水韭的生長經(jīng)歷營養(yǎng)生長期、過渡期、生殖生長期等階段，營養(yǎng)生長期是水韭易受損傷的時期[16]。環(huán)境會影響水生植物生長，但研究表明盡管水韭屬植物數(shù)量少但植物本身的生理特征卻會對水體的化學(xué)性質(zhì)產(chǎn)生影響[17]。因此研究自然生境下水韭孢子體生長過程的生理特征可為研究該屬其他方面的生理提供基礎(chǔ)資料。

植物需通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，保持滲透平衡，進行光合作用等才能維持其正常的生長，其生理變化能反應(yīng)最基本的生物學(xué)特征也為研究其他逆境如污染、農(nóng)藥、低溫等條件提供基礎(chǔ)參數(shù)[18]。通過分析和研究三種水韭生長過程中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及光合參數(shù)等生理指標(biāo)，在理論上不僅能客觀的反映三種水韭的親緣關(guān)系，了解中國產(chǎn)水韭基本生理規(guī)律，揭示水韭科植物瀕危的生理機制；在實踐上也能根據(jù)其生理變化更適當(dāng)?shù)脑O(shè)置其生長環(huán)境條件，為我國水韭的繁殖保護提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料均為中國特產(chǎn)珍稀瀕危水韭屬植物中華水韭、東方水韭和云貴水韭，分別采自浙江建德、浙江松陽、貴州平壩，由于野生水韭數(shù)量極少，本文均用其人工繁殖植株為供試材料。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2013年4月在哈爾濱師范大學(xué)溫室（126° 42' E，45° 24' N）育苗區(qū)進行。溫室培養(yǎng)條件為光照時間10 ～ 14 h/d，光照強度600 ～ 800 μmol·m-2·s-1，溫度20 ～ 28℃，相對濕度85% ～ 95%。將中華水韭孢子播入高15 cm、長10 cm、寬6 cm的多個聚乙烯盒中。待幼苗長至10 cm后將300株幼苗移栽至10個40 cm×70 cm ×20 cm聚乙烯塑料方盆中，每盆30株。移栽后進行7 d適應(yīng)性培養(yǎng)后，每28 d隨機挑選長勢良好植株采樣測定，于140 d結(jié)束實驗。每次測量各指標(biāo)均需要葉片總量0.9 g，不同年齡段植株重量不同，依據(jù)所需葉片總量采相應(yīng)數(shù)量的株數(shù)進行測量。東方水韭和云貴水韭育苗方法及實驗方法同中華水韭一樣。其中1 ～ 56 d為營養(yǎng)生長期、57 ～ 84 d為過渡期、85 ～ 140 d為生殖生長期[16]。

1.3 研究方法及數(shù)據(jù)處理

可溶性糖含量采用蒽酮比色法[19]，可溶性蛋白質(zhì)參照汪家政編著的《蛋白質(zhì)技術(shù)手冊》中的方法[20]，葉綠素含量的測定參照喻曉麗的方法[21]，呼吸速率的測定采用微量定積檢壓法測定[22]，光合參數(shù)的測定采用美國LI-6400光合作用儀測定。

用Excel應(yīng)用軟件制作圖表，數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計分析軟件SPSS17.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同水韭生長過程中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的變化

由圖1可以看出，三種水韭的可溶性糖含量整體差異不顯著，56 d的中華水韭和東方水韭含量基本一致但明顯高于云貴水韭，112 d的三種水韭的含量差異不顯著，140 d的中華水韭和東方水韭顯著高于云貴水韭，且云貴水韭呈下降趨勢。

由圖2可以看出三種水韭在生長過程中的可溶性蛋白含量呈上升趨勢且1 d的中華水韭高于其他兩種，中華水韭和云貴水韭呈先下降后上升至基本穩(wěn)定趨勢，除85 ～ 140 d外云貴水韭含量高于中華水韭，其他生長過程中含量基本一致。

圖2 3種水韭可溶性蛋白含量變化Figure 2 Changes of soluble protein content in 3 species of Isoetes

2.2 三種水韭葉綠素及光合系統(tǒng)生長過程中的變化

由圖3可以看出三種水韭的葉綠素含量在第1天中華水韭要高于東方水韭和云貴水韭后兩者基本一致，在1 ～ 28 d均呈上升趨勢但東方水韭＞中華水韭＞云貴水韭，29 ～ 84d東方水韭和云貴水韭葉綠素含量有所下降但仍高于中華水韭，85 ～ 112d東方水韭＞云貴水韭＞中華水韭，112 d之后與前28 天趨勢一致。

由圖4可以看出三種水韭凈光合速率呈持續(xù)上升趨勢，在前28 天中華水韭光合速率顯著升高。28 ～ 56d中華水韭和云貴水韭光合速率與前一時期比變化不顯著，東方水韭葉片凈光合速率顯著升高。57 ～ 84 d三種水韭葉片光合速率呈持續(xù)上升趨勢，生長到84 d后測定三種水韭凈光合速率均高于56 d約2倍。85 ～ 140d的各時期凈光合速率變化不顯著。

圖3 3種水韭葉綠素含量變化Figure 3 Changes of chlorophyll content in 3 species of Isoetes

圖4 3種水韭凈光合速率變化Figure 4 Changes of Pnin 3 species of Isoetes

由圖5所示東方水韭和云貴水韭在生長過程中胞間二氧化碳濃度總體呈先升高后下降趨勢，自1 ～ 28 d兩種水韭胞間二氧化碳濃度上升，以后逐漸下降，140 d達到最低值。其中東方水韭自28 d后胞間二氧化碳濃度上升幅度波動較小，自84 d后大幅下降至112 d時低于84 d的21.7%，而后緩慢下降；云貴水韭自28 d后逐漸呈下降趨勢，波動幅度較小。中華水韭在生長過程中胞間二氧化碳濃度總體呈先下降后上升再下降趨勢，自1 d下降，28 d后上升，56 d后大幅下降至112 d達到最低值。

由圖6可以看出三種水韭的氣孔導(dǎo)度均呈先上升后下降再上升的趨勢，1 ～ 56 d期間呈上升趨勢，57 ～ 84 d的三種水韭氣孔導(dǎo)度分別比56 d下降10%、15.5%、10.5%，112 d的三種水韭氣孔導(dǎo)度差異不顯著，112 ～ 140 d又顯著升高，1 ～ 112 d中華水韭與東方水韭的氣孔導(dǎo)度顯著高于云貴水韭，112 ～ 140 d三種水韭差異不顯著。

圖5 3種水韭胞間二氧化碳濃度變化Figure 5 Changes of Ciin 3 species of Isoetes

圖6 3種水韭氣孔導(dǎo)度變化Figure 6 Changes of Gsin 3 speices of Isoetes

2.3 三種水韭孢子體生長過程中蒸騰速率及呼吸速率的變化

由圖7可以看出1 ～ 56d期間三種水韭蒸騰速率均顯著升高，自56 d開始呈下降趨勢，140 d的蒸騰速率恢復(fù)到56 d水平。其中中華水韭和云貴水韭的蒸騰速率高于東方水韭，57 ～ 112 d的三種水韭均有所下降，但云貴下降顯著，且84 d測定，中華水韭＞東方水韭＞云貴水韭，113 ～ 140 d三種水韭均呈上升趨勢。在生長發(fā)育過程中三種水韭間蒸騰速率差異不大，其中中華水韭蒸騰速率在各時期普遍高于東方水韭，56 d的云貴水韭蒸騰速率顯著高于東方水韭，略高于中華水韭，但差異不顯著。

圖7 3種水韭蒸騰速率變化Figure 7 Changes of Trin 3 species of Isoetes

圖8 3種水韭呼吸速率變化Figure 8 Changes of Rdin 3 species of Isoetes

由圖8可以看出，1 ～ 28 d三種水韭的呼吸速率均顯著下降，然后一直緩慢上升，整個過程中，東方水韭的呼吸速率均高于其它二種水韭。

3 結(jié)論與討論

營養(yǎng)生長時期各生理指標(biāo)相較于其他時期活躍，但這一時期可溶性蛋白含量、可溶性糖含量下降，葉綠素含量顯著升高；蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度的顯著升高，說明這一時期對水分的需求量很大；上述結(jié)果表明三種水韭在這一時期各項生理指標(biāo)變化顯著，生長速度快，因此是水韭最敏感時期，環(huán)境的略微變化都可能影響水韭成活率，此時的水韭競爭力非常弱，藻類等潮濕環(huán)境易滋生的植物皆會對其產(chǎn)生影響，邢建嬌等人觀察也表明這一時期是水韭病害和蟲害的多發(fā)時期[16]。

中華水韭和東方水韭可溶性糖含量積累非常顯著，云貴水韭可溶性糖積累量沒有前兩種高。三種水韭在這一時期的可溶性蛋白含量積累量并不明顯，葉綠素含量上升顯著，凈光合速率上升不顯著，呼吸速率變化顯著，其中中華水韭呼吸速率略有下降，這可能是糖含量積累的原因之一，可能與其特殊的代謝途徑有關(guān)。但可以發(fā)現(xiàn)三種水韭氣孔導(dǎo)度升高有限[23～24]。蒸騰速率仍然較高，對水分要求較高，且這一時期可以明顯觀察到孢子囊的出現(xiàn)[25]?？梢哉J為這一時期是第一批孢子囊向成熟發(fā)育關(guān)鍵階段，這一時期環(huán)境的變化很可能影響孢子囊的發(fā)育和成熟[16]。

過渡期中華水韭和東方水韭可溶性蛋白含量緩慢增加，可溶性糖含量略有下降，云貴水韭可溶性糖和可溶性蛋白含量上升幅度相對較大，三種水韭葉綠素含量變化都不顯著，但是呼吸速率和凈光合速率都顯著增加，三種水韭的氣孔開度和蒸騰速率減小?？梢钥闯鲞@一時期是三種水韭進一步發(fā)育的時期。

生殖生長時期云貴水韭可溶性糖和可溶性蛋白含量及葉綠素含量變化趨于平緩，這與周厚高結(jié)果一致，凈光合速率和呼吸速率基本都成緩慢上升的趨勢，氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率在一定范圍內(nèi)持續(xù)波動[26]。在112 d可以觀察到云貴水韭少數(shù)植株出現(xiàn)成熟孢子囊。而中華水韭和東方水韭可溶性糖和可溶性蛋白含量及葉綠素含量繼續(xù)緩慢上升，凈光合速率和呼吸速率上升顯著，在140 d才觀察到中華水韭和東方水韭都出現(xiàn)少量成熟孢子囊。

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Sporophyte Growth and Physiological Properties of Three Endangered Species of Isoetes

CHENG Shu-ying1，GUAN Wei-Yuan2，XU Yong-Xing2，LIU Bao-dong1，GUAN Yang1*
（1. Harbin Normal University, Harbin 150025, China; 2. Jiande Foestry Institute of Zhejiang, Jiande 311600, China）

Isoetes sinensis, I. orientalis and I. yunguiensis collected respectively from Jiande, Songyang of Zhejiang province and Pingba of Guizhou province were reproduced for determination of physiological and biochemical index. Results showed that soluble sugar and protein content in three species of Isoetes decreased slightly at vegetative growth period, but increased later. Chlorophyll content increased at seedling stage, slowed down at transit period, and then increased again. Photosynthetic parameters of tested species increased first, decreased and increased. Tested Isoetes had no evident increase of net photosynthetic rate (Pn) at seedling stage, but had evident change of respiratory rate (Rd), and decrease of stomatal conductance (Gs) transpiration rate (Tr).

Isoetes; sporophyte growth; physiological property

S718.43

A

1001-3776（2015）03-0011-05

2015-01-30；

2015-04-11

國家自然科學(xué)基金項目（31170294）

程樹穎（1990-），女，安徽利辛人，碩士生，從事植物生理生態(tài)學(xué)研究；*通訊作者。