楊其清，曹 杰，周勇志，侯加法，周金林

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室, 上海200241，2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京210095）

·研究論文·

犬吉氏巴貝斯蟲截短型抗原BgTRAP的重組表達(dá)及其在診斷上的初步應(yīng)用

楊其清1,2，曹 杰1，周勇志1，侯加法2，周金林1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點開放實驗室, 上海200241，2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京210095）

吉氏巴貝斯蟲BgTRAP蛋白是一個重要的診斷抗原候選分子。為建立一種實用的犬吉氏巴貝斯蟲血清學(xué)診斷方法，本研究選取BgTRAP C-末端跨膜區(qū)前，包含TSP功能區(qū)和抗原區(qū)的411個氨基酸的編碼基因片段，重組表達(dá)了一個可溶性截短型BgTRAP抗原，解決了完整蛋白重組表達(dá)純化的困難。免疫熒光試驗表明，截短型抗原具有良好的抗原性。純化的截短型抗原作為酶聯(lián)免疫試驗診斷抗原，可清晰地區(qū)分陰性及陽性犬血清，并與其他病原感染無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性。犬感染吉氏巴貝斯蟲系列血清檢測表明，該抗原可檢測早期感染（4 d）和感染200 d以后的樣本。結(jié)果提示，重組BgTRAP截短型抗原可作為一種診斷制劑檢測犬吉氏巴貝斯蟲抗體。

犬吉氏巴貝斯蟲；截短型BgTRAP；診斷

吉氏巴貝斯蟲是寄生在犬紅細(xì)胞中的一種蜱傳原蟲，是犬梨形蟲?。ㄋ追Q焦蟲?。┑闹饕≡唬梢鹑l(fā)熱、貧血、血紅蛋白尿和消瘦，甚至死亡[1,2]。目前，吉氏巴貝斯蟲病的診斷主要依賴于紅細(xì)胞染色鏡檢，但對于紅細(xì)胞染蟲率低的非急性感染診斷困難。因此，建立檢測抗體的吉氏巴貝斯蟲病血清學(xué)診斷方法極其重要[3,4]。早期用蟲體抗原進(jìn)行血清學(xué)診斷，其敏感性和特異性均不夠理想。近幾年，鑒定蟲體重要抗原分子并應(yīng)用重組蛋白進(jìn)行血清學(xué)診斷取得了較大進(jìn)展[4-8]，其中，頂復(fù)體分泌蛋白BgTRAP（Babesia gibsoni thrombospondin-related adhesive proteins，凝血酶致敏相關(guān)粘附蛋白）是一個與細(xì)胞入侵有關(guān)的重要抗原分子，其原核表達(dá)的完整重組蛋白顯示了一定的診斷價值[9,10]。但是BgTRAP全長編碼基因表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體形式存在，可溶性蛋白表達(dá)量極少，分離純化非常困難，不利于拓展該分子在診斷上的進(jìn)一步應(yīng)用。本研究通過對其編碼基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選擇主要免疫原性蛋白編碼基因片段，重組高效表達(dá)其可溶性截短型抗原，并評估其截短型抗原作為酶聯(lián)免疫聯(lián)吸附試驗（enzyme-linked immunoSorbent assay，ELISA）診斷抗原的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 菌種質(zhì)粒大腸桿菌菌株DH5α、BL21（DE3）及含有吉氏巴貝斯蟲 TRAP全長基因的克隆質(zhì)粒pBluescript SK(+)/BgTRAP，均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所動物寄生蟲病研究室提供；pGEX-4T-1載體購自Amersham Pharmacia Biotech 公司；pGEM-T Easy 載體購自Promega公司。

1.2 血清樣本犬吉氏巴貝斯蟲人工感染犬血清、正常犬血清、犬巴貝斯蟲、犬巴貝斯蟲羅氏株感染血清、犬巴貝斯蟲韋氏株感染血清、犬巴貝斯蟲指名株感染血清由日本國立原蟲病研究中心饋贈；犬感染伊氏錐蟲和剛第弓形蟲血清由上海獸醫(yī)研究所提供。

1.3 試劑DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，以及Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker購自TaKaRa公司；TEMED、Acr、Bis、T4 DNA連接酶購于Promega公司；氨芐青霉素、瓊脂糖、IPTG、X-gal購自上海生工生物工程有限公司；透析袋、DTT、蛋白胨、酵母提取物、低分子量蛋白Marker購自上海普飛生物技術(shù)有限公司；感受態(tài)細(xì)胞購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司；羊抗犬IgG-HRP購于BETHYL Laboratories；ABTS [2,20-azinobis （3-ethylbenzthiazoline sulfonic acid）] 購于Sigma公司。

1.4 引物根據(jù)報道的吉氏巴貝斯蟲BgTRAP基因序列和編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析[9]，選取C-末端跨膜區(qū)前,包含TSP功能區(qū)和抗原區(qū)的411個氨基酸的1284 bp編碼基因片段，設(shè)計PCR擴增引物：TRAP-F∶ 5'-GC GAATTCAGTGCACTGGCCCTTGAAGAG-3' (包含EcoR Ⅰ酶切位點GAATTC)；TRAP-R∶ 5'-GACTCG AGCTTGTACTCCCAGAAAAGAG-3' (包含Xho Ⅰ酶切位點CTCGAA)，引物由賽百盛公司合成。

1.5 BgTRAP基因的選擇性片段的克隆和表達(dá)以含全長TRAP基因的重組質(zhì)粒pBluescript SK(+)/ BgTRAP為模板、TRAP-F和TRAP-R為引物進(jìn)行截短型抗原基因片段的PCR擴增，PCR擴增條件：94℃預(yù)變性2 min；然后94℃變性45 s，55℃退火 1 min，72℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸7 min。PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)物于1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳分析。用DNA膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，將純化產(chǎn)物經(jīng)EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切后，在T4 DNA連接酶作用下，連接于經(jīng)同樣內(nèi)切酶酶切處理的pGEX-4T-1質(zhì)粒中。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和PCR鑒定，陽性的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21（DE3）。重組表達(dá)菌在37℃、1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)下進(jìn)行表達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。重組蛋白用GST融合蛋白純化系統(tǒng)純化，BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.6 重組蛋白抗血清的制備和免疫熒光試驗將純化的重組蛋白免疫小鼠，按常規(guī)免疫方法制備抗血清。免疫熒光試驗參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行：選優(yōu)質(zhì)載玻片，洗凈后浸泡于無水乙醇和乙醚等量混合液中，用時取出用綢布擦凈。將PBS洗凈后的感染吉氏巴貝斯蟲犬紅細(xì)胞滴于玻片上，用含2.5%丙酮的甲醇固定30 min，固定后以冷的PBS（0.01 mol/L、pH 7.4）浸泡沖洗，制備感染巴貝斯蟲紅細(xì)胞抗原片，最后以蒸餾水沖洗，防止自發(fā)性熒光。取固定標(biāo)本，加不同稀釋度的重組GST-TRAP免疫鼠血清（試驗組）或重組GST免疫鼠血清（對照組），37℃孵育30 min。PBS沖洗3次，每次5 min，再加1∶5000稀釋的熒光標(biāo)記的羊抗鼠抗體，37℃孵育30 min。PBS沖洗 3次，每次5 min，加含50 μg/mL RNase A 的6.25 μg/mL propidium iodide（PI）。PBS沖洗 3次，每次5 min，加甘油緩沖液，封片，熒光顯微鏡檢和激光顯微鏡檢查。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

1.7.1 特異性分析 選用人工感染吉氏巴貝斯蟲的犬血清、正常犬血清、犬巴貝斯蟲感染血清、伊氏錐蟲感染犬血清和剛第弓形蟲感染犬血清，以重組蛋白為診斷抗原，檢測ELISA方法的特異性。其中重組蛋白GST-TRAP和對照GST蛋白分別以0.1 μg/mL包被96孔板，空白對照加PBS。待檢血清用PBST 1∶200稀釋，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用PBST 1∶4000稀釋使用。底物為新配制的ABTS酶底物液，ELISA結(jié)果用酶標(biāo)儀在波長415 nm處測OD值表示。

1.7.2 人工感染犬抗體消長檢測 約10 000個吉氏巴貝斯蟲染蟲紅細(xì)胞經(jīng)皮下注射人工感染的比格犬，感染后從0～200 d的不同時間段，分別采集犬血液，制備感染后不同時間的系列血清，應(yīng)用本研究建立的ELISA方法進(jìn)行犬體內(nèi)抗體消長的檢測分析。

2 結(jié)果

2.1 BgTRAP編碼基因及其演繹蛋白的生物信息學(xué)分析周金林等[9]在2006年首次報道了吉氏巴貝斯蟲BgTRAP分子的鑒定，該分子為頂復(fù)體分泌的具有很強免疫原性的功能分子，與吉氏巴貝斯蟲入侵紅細(xì)胞的生物學(xué)過程密切相關(guān)。BgTRAP全長cDNA序列已登錄GenBank，序列號：AB053292。BgTRAP基因全長2373 bp，含有一個編碼735個氨基酸的開放閱讀框架（open reading frame，ORF）。SignalP軟件（http∶//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測顯示，在其演繹蛋白的N-端有一個疏水性的信號肽序列；成熟的蛋白由713個氨基酸構(gòu)成，分子量為80 kDa。蛋白質(zhì)含有 vWFA 和TSP1兩個功能結(jié)構(gòu)域；在C-末端有一個轉(zhuǎn)膜區(qū)；另外，在TSP1和轉(zhuǎn)膜區(qū)間是谷氨酸富含區(qū)，包括3個五聯(lián)谷氨酸重復(fù)，是蛋白質(zhì)免疫原性區(qū)段。BgTRAP預(yù)測蛋白的結(jié)構(gòu)分析（http∶//smart.embl-heidlberg.de /smart/job_status.)見圖1。

圖1 BgTRAP蛋白分子的一級結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The illustration of deduced protein BgTRAP primary structure

2.2 BgTRAP截短型基因的克隆和表達(dá)以含有全長吉氏巴貝斯蟲BgTRAP基因序列的質(zhì)粒pBluescript SK(+)/BgTRAP為模板，經(jīng)截短型基因特異性引物TRAP-F和TRAP-R的PCR擴增，獲得大小為1233 bp左右的特異片段（圖2)，與預(yù)期大小一致。目的基因經(jīng)膠回收，連接于表達(dá)質(zhì)粒pGEX-4T-1中，陽性質(zhì)粒通過測序分析，證實目的基因已連接到表達(dá)載體質(zhì)粒中。重組陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21（DE3）后，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明，空質(zhì)粒pGEX-4T-1表達(dá)的GST標(biāo)簽蛋白為26 kDa左右，重組質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白約為71 kDa左右，與預(yù)期大小45 kDa基本一致。細(xì)菌經(jīng)反復(fù)冰融和超聲波處理后，并用SDS-PAGE檢測，表明該融合蛋白以可溶性的蛋白形式存在，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)GST融合蛋白純化系統(tǒng)純化，得到單一條帶（圖3）。

圖2 吉氏巴貝斯蟲BgTRAP基因PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.2 PCR products of BgTRAP

圖3 重組蛋白BgTRAP蛋白的表達(dá)與純化Fig.3 Expression and purifi cation of recombinant truncated BgTRAP

2.3 重組蛋白抗血清的制備和免疫熒光試驗重組截短型蛋白和對照GST蛋白免疫小鼠后，經(jīng)瓊脂擴散實驗測定效價1∶16以上，眼球采血，制備抗血清?？寡逄荻认♂尯筮M(jìn)行免疫熒光實驗，結(jié)果表明，抗重組蛋白的抗血清可以與紅細(xì)胞中的蟲體發(fā)生特異性反應(yīng)，而與宿主紅細(xì)胞無反應(yīng)。對照GST蛋白的抗血清則無反應(yīng)信號（圖4）。

圖4 抗重組蛋白抗血清與吉氏巴貝斯蟲表面反應(yīng)的激光顯微圖Fig.4 Localization of antigens recognized by the antirBgTRAP serum in confocal laser micrographs

2.4 ELISA方法特異性實驗結(jié)果表明，重組BgTRAP作為ELISA 診斷抗原，可以明確區(qū)分吉氏巴貝斯蟲感染犬血清和正常犬血清，而對照GST蛋白則對陰性和陽性血清樣品都沒有反應(yīng)。犬巴貝斯蟲不同亞種、犬弓形蟲和錐蟲感染血清測試結(jié)果顯示，只有吉氏巴貝斯蟲感染犬血清能被檢測出，其他寄生蟲感染血清均為陰性（圖5）。

2.5 感染吉氏巴貝斯蟲犬抗體消長的ELISA檢測以重組蛋白為抗原建立的ELISA方法進(jìn)行檢測，對一條人工感染吉氏巴貝斯蟲的犬的系列血清的檢測結(jié)果表明，感染后4 d即可檢測到明顯的抗體，7 d后抗體維持在較高的水平，到感染后207 d抗體均維持較高水平，此時犬感染后紅細(xì)胞染蟲率很低（圖6）。

圖5 重組蛋白為抗原的ELISA方法特異性檢測Fig.5 The specifi city of ELISA using the recombinant truncated BgTRAP as diagnosis antigen

圖6 人工感染吉氏巴貝斯蟲犬的抗體消長變化Fig.6 Dynamic changes of antibody to rBgTRAP in a dog experimentally infected with B.gibsoni

3 討論

通過去除跨膜區(qū)等疏水性區(qū)域編碼基因的方法，重組表達(dá)截短型可溶性蛋白已有不少成功范例[11,12]。吉氏巴貝斯蟲BgTRAP分子量為80 kDa，從N端到C端，依次含有信號肽、vWFA 和TSP1兩個功能結(jié)構(gòu)域、谷氨酸富含區(qū)和跨膜區(qū)[9]。本研究根據(jù)該分子的結(jié)構(gòu)特點，選取C-末段跨膜區(qū)前, 包含TSP功能區(qū)和抗原區(qū)的45 kDa大小的多肽作為截短型抗原，成功進(jìn)行了高效可溶性表達(dá)。這為該蛋白大量分離純化提供了重要基礎(chǔ)，解決了全長基因表達(dá)的蛋白產(chǎn)量少、難提純的問題。

截短型重組蛋白是否保留抗原性是本研究成敗的另一個關(guān)鍵。通過免疫熒光和激光顯微鏡觀察，證實了該蛋白保留了完整抗原的類似抗原性。以BgTRAP截短型抗原作為ELISA 診斷抗原，可以明確區(qū)分吉氏巴貝斯蟲感染犬血清和正常犬血清，對犬巴貝斯蟲其他亞種感染、錐蟲感染和弓形蟲感染犬血清也沒有交叉反應(yīng)，顯示了該抗原良好的診斷特異性。對感染犬的系列血清的檢測結(jié)果顯示，在感染早期以及慢性感染期均可檢測，表明該重組蛋白具有較好的應(yīng)用價值。

血液原蟲的檢測方法主要依賴血片鏡檢，但低染蟲率常導(dǎo)致漏檢。犬吉氏巴貝斯蟲感染后，紅細(xì)胞染蟲率在2～3 w有一個峰期，容易在血片中觀察到，但在感染早期和慢性期，紅細(xì)胞染蟲率極低，很難用血片觀察到。盡管PCR技術(shù)也可以用于低染蟲率的犬吉氏巴貝斯蟲病的診斷[13-15]，但血清學(xué)檢測方法由于樣本處理簡單并且可同時檢測眾多樣品，特別適合于流行病學(xué)調(diào)查或大量樣本檢測，因此是防治工作中不可替代的重要技術(shù)之一。本研究獲得的高效表達(dá)可溶性截短型BgTRAP抗原，將為研發(fā)相關(guān)診斷試劑盒提供基礎(chǔ)。

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EXPRESSION AND PRELIMINARY APPLICATION OF RECOMBINANT TRUNCATED BGTRAP OF BABESIA GIBSONI

YANG Qi-qing1,2, CAO Jie1, ZHOU Yong-zhi1, HOU Jia-fa2, ZHOU Jin-lin1
(1.Key Laborator of Animal Parasitology of Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2.College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

The BgTRAP protein of Babesia gibsoni is an important candidate for the development of a diagnostic reagent for canine babesiosis.In order to develop a diagnostic method for practical use, the gene fragment encoding truncated BgTRAP that covered TSP region and antigenic area ahead of transmembrane region was cloned and expressed in E.coli in soluble form.The recombinant truncated BgTRAP protein showed strong antigenicity in indirect fluorescent-antibody test and ELISA.The ELISA method using truncated BgTRAP protein was able to differentiate B.gibsoni-infected dog serum and non-infected dog serum.In dogs experimentally infected with B.gibsoni, ELISA method also detected antibody response as early as 4 days, or as late as 200 days post infection.These results demonstrated that the recombinant truncated BgTRAP protein might be a useful diagnostic reagent for detection of B.gibsoni antibodies in dogs.

Babesia gibsoni; truncated BgTRAP; diagnosis

S852.723

：A

：1674-6422（2015）01-0021-06

2014-05-29

衛(wèi)生行業(yè)科研專項經(jīng)費資助項目(201202019)

楊其清, 男，博士，主要從事小動物疾病研究

周金林，E-mail∶ jinlinzhou@shvri.ac.cn