夏 鵬，沈 麗，魏建超，鐘登科，陸瑩梅，李蓓蓓，劉 珂，邵東華，邱亞峰，溫貴蘭，馬志永

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽550025；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241; 3.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)系，上海 201600）

·研究論文·

裂谷熱病毒Gc蛋白主要抗原區(qū)的表達(dá)、純化及鑒定

夏 鵬1,2，沈 麗3，魏建超2，鐘登科3，陸瑩梅2，李蓓蓓2，劉 珂2，邵東華2，邱亞峰2，溫貴蘭1，馬志永2

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽550025；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海200241; 3.上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)系，上海 201600）

根據(jù)裂谷熱病毒（Rift valley fever virus, RVFV）M基因（GenBank 登錄號：DQ380206）序列，用PCR方法擴(kuò)增其主要抗原區(qū)，將目的基因克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pColdⅠ中，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，將表達(dá)蛋白利用His-tag Ni柱進(jìn)行親和層析純化。純化后的蛋白分別應(yīng)用SDS-PAGE、Western blot方法鑒定，結(jié)果顯示，本研究不僅成功表達(dá)出Gc蛋白的主要抗原區(qū)，而且具有良好抗原性，為后續(xù)裂谷熱抗原ELISA試劑盒的研制奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

裂谷熱病毒；Gc蛋白；原核表達(dá)；抗原性

裂谷熱（rift valley fever，RVF）作為一種以蚊子為主要傳播媒介的烈性傳染病，主要傳染反芻動物，也可傳染人。動物感染裂谷熱后多表現(xiàn)為高燒不退、流涕、厭食、急性腹瀉甚至黃疸。犢牛和羔羊的死亡率很高，懷孕母牛羊的流產(chǎn)率達(dá)80%～100%[1]。人感染后癥狀類似于流行性感冒。世界動物衛(wèi)生組織將其列為法定報告病中A類傳染病，我國將其定為一類傳染病。

2000年9月，中東地區(qū)的阿拉伯半島和也門爆發(fā)此病，僅僅三個月就有1087疑似病例，其中121例死亡[2]?，F(xiàn)今非洲東部和南部及阿拉伯半島地區(qū)裂谷熱已成周期性流行[3]。世界各國動物性進(jìn)出口貿(mào)易日益頻繁，而阿拉伯半島又毗鄰亞歐大陸，所以更應(yīng)加強(qiáng)對RVF的檢疫，同時對RVF疫苗的研制也迫在眉睫。裂谷熱沒有特征性臨床癥狀，因此個別病例的診斷較為困難耗時，但該病的大面積傳播有以下特征：大批母畜流產(chǎn)，新生幼畜大批死亡，以及人群發(fā)病。目前的診斷方法主要通過病毒分離、血清學(xué)、核酸技術(shù)等[4]。

裂谷熱病毒（Rift valley fever virus, RVFV）屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）、白蛉熱病毒屬（Phlebovirus），具包膜，與家族的其他病毒一樣，RVFV基因組由三節(jié)段的負(fù)鏈RNA組成，分別為L、M、S節(jié)段。L片段全長6404 nt，反向編碼RNA依賴的RNA聚合酶也稱為L蛋白，M片段反向編碼4個蛋白，其中主要為糖蛋白Gn、Gc，另外2個次要蛋白為14 kDa的非結(jié)構(gòu)蛋白（NSm）和78 kDa的結(jié)構(gòu)蛋白[5]。S節(jié)段長度為1690 nt，利用雙向策略，反義鏈編碼核衣殼蛋白（N），正義鏈編碼一個非結(jié)構(gòu)蛋白(NSs)，2個相向的開放閱讀框之間的基因間區(qū)域?yàn)?1 nt[6]。

糖蛋白對于布尼病毒在高爾基體內(nèi)的成熟具有重要作用，Gn和Gc蛋白參與高爾基體的定位過程。有報道顯示，Gn蛋白C端的48個氨基酸部位 (包括20個氨基酸的跨膜區(qū)域和鄰近的蛋白C末端28個氨基酸) 就是RVFV的高爾基體定位信號，Gc蛋白通過物理作用與Gn蛋白相結(jié)合從而定位于高爾基體[7]。N蛋白是RVFV主要的免疫原，而病毒表面的Gn和Gc蛋白含有中和表位，也能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體[8,9]。RVFV囊膜糖蛋白（G）是由M基因片段編碼的，翻譯后修飾過程中裂解為兩個蛋白（Gn和Gc糖蛋白）[10,11]，是病毒的主要免疫原結(jié)構(gòu)蛋白。本項(xiàng)目分別構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒，在BL21感受態(tài)細(xì)胞中，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)截短囊膜蛋白基因片段，重組蛋白經(jīng)Ni柱His·Band親和層析純化后，獲得純化蛋白，為后續(xù)快速檢測RVF奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料原核表達(dá)質(zhì)粒PcoldⅠ、大腸桿菌感受態(tài)DH5α和大腸桿菌感受態(tài)BL21（DE3）細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存；各種限制內(nèi)切酶分別購自Fermentas公司；Ni NTA His Bind resin蛋白純化試劑盒購自Novagen公司；各種DNA Marker均購自北京天根生物公司；抗His標(biāo)簽鼠源單抗、辣根過氧化物酶( HRP) 標(biāo)記的羊抗鼠二抗購自Sigma公司；In-Fusion?HD Cloning Kit試劑盒購自Clontch公司；小提質(zhì)粒試劑盒和DNA膠回收試劑盒購置于Axygen公司；氨芐青霉素和IPTG購置于Sigma公司；化學(xué)合成裂谷熱病毒M基因（GenBank登錄號：DQ380206）克隆于pUc57質(zhì)粒（M-pUc57），由Invitrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)裂谷熱病毒M基因（GenBank登錄號：DQ380206），DNAStar生物軟件分析Gc基因，確定其主要抗原區(qū)Gc1（2114-2476）、Gc2 （2609-3040），用Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)上下游引物。Gc1-F：5'-ATCGAAGGTAGGCATCTCC AGAATCACCACTTGCT-3'，Gc1-R：5'-TCTAG ACTGCAGGTCTCCACATTGCTCAAAACAC-3'；Gc2-F：5'-ATCGAAGGTAGGCATCACAGACTTT GATGGCTC-3'，Gc2-R：5'-TCTAGACTGCAGGT CTACAGAGCCCTTAGAGAAAG-3'。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 以化學(xué)合成的裂谷熱M片段（GenBank登錄號：DQ380206）為模板，用特異性引物PCR擴(kuò)增Gc基因的主要抗原區(qū)Gc1、Gc2。PCR反應(yīng)體系如下：1μL模板、0.2μL LA Taq酶、上下游引物各0.2 μL、2 μL 10×Buffer、3.2 μL dNTP、dd H2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 4 min；95℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共35個循環(huán)；72℃延伸 5 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 DNA膠回收試劑盒回收純化PCR產(chǎn)物和單酶切原核表達(dá)質(zhì)粒PcoldⅠ，按照In-Fusion?HD Cloning Kit試劑盒說明，55℃連接15 min，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，搖菌，涂含有氨芐青霉素抗性的LB平板，37℃震蕩培養(yǎng)1 h，涂含有氨芐青霉素抗性的LB平板，37℃溫箱培養(yǎng)過夜，挑取單克隆菌落于LB培養(yǎng)液中5 h，用質(zhì)粒小提試劑盒提質(zhì)粒，以提取質(zhì)粒為模板，特異性引物PCR方法擴(kuò)增鑒定，篩選PCR鑒定正確的質(zhì)粒送生物公司測序。測序正確后陽性質(zhì)粒分別命名為PcoldⅠ- Gc1、PcoldⅠ- Gc2。

1.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定 對含有重組陽性質(zhì)粒PcoldⅠ-Gc1、PcoldⅠ-Gc2的BL21 （DE3）宿主菌進(jìn)行培養(yǎng)溫度和誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，確立按1∶100的比例接種于新鮮的LB（含氨芐青霉素抗性）培養(yǎng)液，37℃震蕩培養(yǎng)3 h，IPTG加至終濃度為1.0 mmol/L，18℃振蕩培養(yǎng)24 h。取誘導(dǎo)表達(dá)24 h的菌液，離心取沉淀，用binding buffer懸浮于冰上超聲破碎處理，超聲后的菌體，10 800×g、4℃離心25 min，收集上清并用5×SDS沸水浴5～10 min制樣，菌體用含有6 mol/L 尿素的binding buffer重新懸浮，4℃放置過夜后并制樣（同上清），分別取上清和沉淀樣品，用15% SDS-PAGE鑒定表達(dá)形式。

1.2.5 重組蛋白的純化 將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白，按照His-tag Ni柱進(jìn)行親和層析純化說明書純化重組蛋白，用15%的SDS-PAGE檢測純化效果。

1.2.6 Western blot檢測重組蛋白的表達(dá) 重組蛋白在SDS-PAGE電泳后，0.24A恒安電流下轉(zhuǎn)NC膜（硝酸纖維素膜）2 h，同時設(shè)立陰性對照，室溫封閉2 h，用TBST洗滌3次，一抗分別為抗His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體（稀釋度為1∶5000），以及本實(shí)驗(yàn)室制備和鑒定的兔抗RVFV Gc1和Gc2多克隆抗體（效價達(dá)1∶256 000，稀釋度為1∶1000）[14]，4℃孵育過夜，用TBST洗膜3次，二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗鼠，稀釋度為1∶10 000，二抗室溫孵育2 h，TBST孵育3次，加顯色底物顯色，分析Gc1和Gc2的免疫原性。

2 結(jié)果

2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定根據(jù)DNAStar分析裂谷熱病毒M片段的Gc基因的主要抗原區(qū)Gc1和Gc2大小分別為363 bp和432 bp，克隆入原核表達(dá)質(zhì)粒pColdⅠ，用質(zhì)粒小提取試劑盒提質(zhì)粒，以提取質(zhì)粒為模板，特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1% 瓊脂糖核酸凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示條帶與預(yù)期大小一致（圖1）。把鑒定正確的質(zhì)粒送上海桑尼生物公司和Invitrogen生物公司測序，鑒定結(jié)果表明序列正確沒有發(fā)生突變。

圖1 裂谷熱病毒Gc1、Gc2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.1 Amplifi cation of Gc1 and Gc2 of Rift valley fever virus

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)鑒定及純化將重組陽性質(zhì)粒pColdⅠ-Gc1和pColdⅠ-Gc2轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）細(xì)胞中，37℃搖床震蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)0.4～0.6，以終濃度為1 mmol/L 的IPTG在18℃誘導(dǎo)24 h。取未誘導(dǎo)的菌液、未超聲誘導(dǎo)的菌液、超聲的誘導(dǎo)菌液上清、超聲的誘導(dǎo)菌液沉淀，用15%的SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果顯示，Gc1、Gc2分子量分別約為13 kDa和15 kDa（圖2、圖3），與理論值一致且可以確定其表達(dá)產(chǎn)物在包涵體中。按1.2.4誘導(dǎo)表達(dá)的條件和步驟，得到超聲后沉淀溶于含有6 mol/L 尿素的binding buffer，4℃過夜。樣品用0.22μm膜過濾后，按Ni NTA His·Bind resin蛋白純化試劑盒步驟純化蛋白，取有波峰批次樣品，15%的SDS-PAGE電泳鑒定純化效果，結(jié)果顯示條帶比較單一。

圖2 重組Gc1蛋白表達(dá)產(chǎn)物的鑒定及純化Fig.2 Analysis of expression and purifi cation of recombinant protein Gc1

圖3 重組pColdⅠ-Gc2蛋白表達(dá)產(chǎn)物的鑒定及純化Fig.3 Analysis of expression and purifi cation of recombinant protein Gc2

2.3 純化蛋白的Western bolt分析Western blot結(jié)果顯示，在硝酸纖維素膜上出現(xiàn)與目的蛋白大小一致的條帶，而空載體泳道并未顯示任何條帶，表明所構(gòu)建的pColdⅠ-Gc1、pColdⅠ-Gc2重組表達(dá)菌，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白能夠被商品化的抗His標(biāo)簽鼠源單抗和兔抗RVFV Gc1和Gc2多克隆抗體（本實(shí)驗(yàn)室保存），證明誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白具有良好的抗原性。

3 討論

裂谷熱作為一種最急性或急性人獸共患傳染病，同時也是烈性蟲媒傳染病，蚊子是其重要的傳播媒介，病毒在脊椎動物寄主和蚊子之間循環(huán)[11]。雖然，我國目前還沒有發(fā)現(xiàn)裂谷熱疫情，但近年來，隨著中非貿(mào)易合作規(guī)模的日趨加大，人員流動和交通運(yùn)輸愈加頻繁，地域邊界和天然屏障已很難有效阻止蟲媒病毒的入侵，傳入的風(fēng)險也與日俱增，所以裂谷熱的防控一直備受關(guān)注。

圖4 重組蛋白 Gc1、Gc2的Western blot鑒定Fig.4 Identifi cation of recombinant protein Gc1, Gc2 by Western blot

如今，世界各國動物性進(jìn)出口貿(mào)易日益頻繁，而阿拉伯半島又毗鄰亞歐大陸，所以更應(yīng)加強(qiáng)對RVF的檢疫，同時對RVF疫苗的研制也迫在眉睫。然而，我國在裂谷熱的檢測研究領(lǐng)域還基本上處于空白。面對裂谷熱傳入的威脅，我國應(yīng)提高警惕，密切注視國外疫情變化，并建立一系列的檢測技術(shù)，做好技術(shù)儲備，尤其是建立快速、準(zhǔn)確、簡便、特異的RVF實(shí)驗(yàn)室檢測方法，對于防止裂谷熱從口岸傳入我國具有重要的意義。

由于RVFV屬于高危病毒，需要在生物安全四級實(shí)驗(yàn)室操作，所以目前世界上僅有少數(shù)幾個國家的實(shí)驗(yàn)室能開展裂谷熱的研究，主要集中在歐美等國。關(guān)于裂谷熱病毒的檢測，國外已經(jīng)建立了多種檢測抗原抗體的技術(shù)，比如：病毒分離、RTPCR、熒光定量PCR、ELISA等；檢測抗體的方法有血凝試驗(yàn)、間接免疫熒光、Western blot、ELISA等[13]。由于裂谷熱康復(fù)病人和動物可攜帶抗體，從防止裂谷熱病毒從口岸傳入來看，在建立檢測裂谷熱抗體技術(shù)的同時，檢測RVFV抗原或基因技術(shù)也是非常實(shí)用有效的。從裂谷熱爆發(fā)現(xiàn)場檢測的實(shí)際應(yīng)用結(jié)果來看，ELISA方法具有快速、敏感的優(yōu)點(diǎn)，是檢測RVFV的首選檢測技術(shù)[14]。

本研究成功表達(dá)了Gc蛋白的抗原區(qū)，獲得的純化蛋白具有良好的抗原性，可以被特異性抗體識別，為后續(xù)快速檢測RVFV方法的建立奠定了基礎(chǔ)。

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EXPRESSION, PURIFICATION AND IDENTIFICATION OF THE MAJOR ANTIGENIC REGION OF GC PROTEIN OF RIFT VALLEY FEVER VIRUS

XIA-Peng1,2, SHEN-Li3, WEI Jian-chao2, ZHONG Deng-ke3, LU Ying-mei2, LI Bei-bei2, LIU Ke2, SHAO Dong-hua2, QIU Ya-feng2, WEN Gui-lan1, MA Zhi-yong2
(1.College of Animal Science,Guizhou University, Guiyang 550025, China; 2.Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 3.Department of Animal Science and Technology, Shanghai Vocational and Technical College of Agriculture and Forestry, Shanghai 201600, China)

The major antigenic region fragments were designed and amplifi ed with PCR according to the M whole genome sequence of Rift valley fever virus (RVFV) in GenBank (GenBank ACCESSION: DQ380206).The synthesized gene was sub-cloned into plasmid Pcold I, and the recombinant protein was induced by iptg after the recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 competent bacteria.The expressed protein was purified with His-Tag Ni+.The results of SDS-PAGE and Western blot demonstrated that the purifi cation of protein was successfully expressed with good antigenicity.The research makes a huge contribution to develop an ELISA kit for detecting Rift valley fever virus.

Rift valley fever virus; Gc protein; prokaryotic expression; anfi genicity

S852.659.5

：A

：1674-6422（2015）01-0015-06

2014-12-02

國家科技支撐計(jì)劃（2013BAD12B05）; 國家自然科學(xué)基金（31302116）;上海高校青年教師培養(yǎng)資助計(jì)劃（ZZnlzl2003）上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院院級科研項(xiàng)目（091227）

夏鵬，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

溫貴蘭，E-mail：guilanwen@hotmail.com；馬志永，E-mail：zhiyongma@shvri.ac.cn