靳紅亮，劉 曄，李 楠，李志君,3，趙敬慧，王述超，張守峰，扈榮良

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122；3.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長春 130021）

·研究論文·

犬源偽狂犬病毒的分離與鑒定

靳紅亮1,2，劉 曄2，李 楠2，李志君2,3，趙敬慧2，王述超2，張守峰2，扈榮良2

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春130118；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122；3.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，長春 130021）

2012與2013年冬季，本實驗室從長春市某寵物診所連續(xù)收到疑似偽狂犬病毒感染的2份犬腦組織病料，接種Vero細胞，分離到2株病毒，經(jīng)電鏡觀察、動物回歸試驗及PCR擴增鑒定為偽狂犬病毒，命名為JLCC-2012和JLCC-2013株。PCR擴增病毒gC基因序列，經(jīng)遺傳進化分析顯示，2株P(guān)RV gC基因同源性為100%，且與國內(nèi)犬源分離株BJ/RD、BJ/YT同源性分別為99.93%、100%，與豬源病毒分離株同源性為94.33%～100%，與國外豬源病毒分離株同源性為93.58%～94.81%。結(jié)果表明本研究分離株為與最近報道的犬源毒株系相近的流行毒株。

偽狂犬病毒；分離；鑒定；感染；基因分析；犬

偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）屬于I型皰疹病毒，為皰疹病毒科甲亞科家族中的一員，感染豬后可引起一種以腦脊髓炎為主要臨床癥狀的急性高度傳染性傳染病[1]。除了豬以外，PRV可感染多種其他哺乳動物，包括反芻動物、食肉動物和嚙齒類動物等[2,3,5]。犬通過攝食未經(jīng)煮熟的豬骨頭和內(nèi)臟也可感染。犬感染的潛伏期較短，一般1～6 d，多在發(fā)病出現(xiàn)臨床癥狀后幾天內(nèi)死亡，死亡率100%[4]。目前豬群通過接種減毒活疫苗或滅活苗，患病率已大大降低[6-8]。但由于多種原因，尤其是因漏免導(dǎo)致的潛伏感染，常有帶毒豬產(chǎn)品進入市場，犬在食用這些帶毒豬產(chǎn)品后，常有偽狂犬病發(fā)生。

PRV基因組為線性DNA，長約150 kb，由長獨特區(qū)（UL)、短獨特區(qū)（US）以及US兩側(cè)的末端重復(fù)序列（TR）和內(nèi)部重復(fù)序列（IR）構(gòu)成，可編碼70～100種蛋白[1]。其中g(shù)C蛋白與PRV的毒力有關(guān)，也是病毒復(fù)制的非必需區(qū)[9]。gC蛋白通過和細胞表面的肝素樣受體相互作用，在PRV攻擊靶細胞中起著非常重要的作用[10,11]。另外，gC蛋白也是PRV主要保護性抗原之一，可以刺激機體產(chǎn)生保護性抗體[10,12]。

本研究從具有神經(jīng)癥狀的病犬腦組織中分離和鑒定了2株偽狂犬病毒，對其gC基因進行了擴增、測序及比對分析，旨在闡明其分子流行病學(xué)特點，為該病的預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病料和細胞本研究所用病料分別于2012和2013年冬季采自長春市某寵物診所送檢的病犬。按照送檢人的敘述，病犬表現(xiàn)為瘙癢癥狀，用爪極力抓撓頭部，后期采食能力喪失，最終死亡，據(jù)此初步診斷為偽狂犬病。采集腦組織后置-20℃保存?zhèn)溆谩ero細胞由軍事獸醫(yī)研究所流行病學(xué)實驗室保存，細胞在含有5%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基（購自Gibco公司）中培養(yǎng)。

1.2 引物根據(jù)參考文獻[13]已發(fā)表的PRV gC基因序列（GenBank登錄號：KC981239）設(shè)計其全長擴增引物，擴增產(chǎn)物大小為1600 bp，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。其序列如下：

1.3 病毒分離無菌條件取病料剪碎后，加入適量的生理鹽水和細胞培養(yǎng)基，用組織研磨棒研碎，制成懸液，反復(fù)凍融3次，10 800×g 離心 15 min，取上清加入雙抗，4℃過夜；用 0.22 μm一次性濾器過濾除菌，取500 μL病毒懸液接種至80%單層Vero細胞，37℃感作1 h；加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；每天觀察細胞病變（cytopathic effect，CPE），出現(xiàn)CPE后，用2%磷鎢酸負染，透射電鏡下觀察。

1.4 病毒TCID50測定使用Vero細胞在96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)測定，并按K?ber法計算分離毒TCID50[14]。

1.5 本動物回歸試驗3月齡健康犬9只均分為3組。第1組接種JLCC-2012株病毒細胞培養(yǎng)物（107.5/0.1mL TCID50），3 mL/只，肌肉注射和滴鼻途徑各1.5 mL；第2組接種JLCC-2013株病毒細胞培養(yǎng)物（107.75/0.1 mL TCID50），3 mL/只，肌肉注射和滴鼻途徑各1.5 mL；第3組注射相同劑量的無菌DMEM培養(yǎng)基作對照。相同條件分籠飼養(yǎng)，每天觀察其發(fā)病死亡情況。

1.6 病毒基因組DNA提取及gC基因擴增及測序取90%以上細胞病變的培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次。取200 μL置于DEPC水處理過的1.5 mL滅菌離心管中，使用病毒DNA小量試劑盒（Axygen）提取病毒DNA。取病毒基因組DNA進行g(shù)C基因擴增時，PCR反應(yīng)體系為50μL，反應(yīng)管依次加入滅菌ddH2O 28 μL、5×GC buffer 10 μL、DMSO 1.5 μL、10 mmol/ mL dNTP 1 μL、上下游引物各2.5 μL、模板DNA 4 μL，最后加入Phusion DNA polymerase 0.5μL。gC基因擴增條件：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物用1%TAE瓊脂糖凝膠電泳，回收擴增產(chǎn)物送吉林省庫美生物科技有限公司測序。

1.7 PRV gC基因序列分析采用DNAStar軟件對測序結(jié)果進行序列比對，將其核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中其他PRV毒株的gC基因進行同源性分析比較，并基于gC基因序列用MEGA5.2分析軟件以Neighbor-joining法繪制遺傳進化樹進行遺傳進化分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離、電鏡觀察和PCR檢測病料濾液接種Vero細胞24 h后開始出現(xiàn)細胞圓縮、聚集，48 h后細胞開始慢慢脫落。取凍融細胞培養(yǎng)物上清用2%磷鎢酸進行負染，透射電鏡下觀察，可見典型呈圓形、帶囊膜的成熟病毒粒子。結(jié)果初步表明所分離的2株病毒均為偽狂犬病毒，將其命名為JLCC-2012和JLCC-2013株（圖1）。

圖1 犬病料的診斷結(jié)果Fig.1 Diagnosis results of brain samples from the diseased dogs

2.2 病毒TCID50測定取分離株連續(xù)培養(yǎng)至第5代的病毒，在Vero細胞上測定TCID50。按K?ber法計算，JLCC-2012與JLCC-2013株的TCID50分別為107.5/0.1 mL、107.75/0.1 mL。

2.3 本動物回歸試驗3月齡健康犬接種JLCC-2012與JLCC-2013株病毒細胞培養(yǎng)物24 h后體溫升高，最高可達42℃。48 h后開始出現(xiàn)明顯臨床癥狀，表現(xiàn)為精神不振，接種部位出現(xiàn)典型瘙癢癥狀，頻頻回頭撕咬接種部位及周圍組織，用爪極力抓撓頭部，后期四肢麻痹，臥地不起，最終衰竭而死。結(jié)果表明JLCC-2012與JLCC-2013株對3月齡犬具有致病性，并且表現(xiàn)出典型的偽狂犬病神經(jīng)癥狀。

2.4 PRV gC基因的擴增利用PCR從病毒基因組DNA中擴增gC基因，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，JLCC-2012與JL-CC2013均擴增出約為1.6 kb大小的特異性條帶（圖2），與預(yù)期相符，并經(jīng)序列分析驗證為偽狂犬病毒的gC基因序列，由此，進一步證實2株分離株均為偽狂犬病毒。

圖2 JLCC-2012株與JLCC-2013株 gC基因PCR產(chǎn)物Fig.2 PCR product of gC gene of JLCC-2012 and JLCC-2013

2.5 PRV gC基因序列分析JLCC-2012和JLCC-2013 株gC基因均包含一個大小為1464 bp完整的開放性閱讀框（open reading frame，ORF），編碼487個氨基酸。用Clustalw軟件基于gC基因核苷酸序列繪制遺傳進化樹，結(jié)果顯示，JLCC-2012和JLCC-2013株同源性為100%，與國內(nèi)犬源分離株BJ/RD、BJ/YT同源性分別為99.93%、100%；與豬源偽狂犬病毒分離株同源性為94.33%～100%；與國外豬源性狂犬病毒分離株的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列變異率較高，同源性為93.58～94.81%（圖3）。

圖3 偽狂犬病毒 gC基因遺傳進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis based on gC gene of Pseudorabies virus

3 討論

近年來，盡管偽狂犬病減毒活疫苗和滅活疫苗的應(yīng)用在預(yù)防和控制豬群感染發(fā)病取得了很好的效果，一些地區(qū)仍不斷有該病暴發(fā)的報道。大量研究證實，疫苗株和強毒力株在豬群中發(fā)展為潛伏感染，在一定條件下通過某些途徑傳播感染其他哺乳動物（犬、貓、牛、羊等）和野生動物（狼、狐貍、臭鼬等）[15-20]。犬主要是通過攝食未經(jīng)煮熟豬的骨頭和內(nèi)臟而感染，一旦發(fā)病后幾天內(nèi)死亡。長春市某寵物診所每年都收到一些具有神經(jīng)癥狀的犬病例，其中一些診斷為犬瘟熱，個別為狂犬病，另有一些懷疑為偽狂犬病，但由于診斷條件有限，很少獲得確定性證據(jù)。本實驗室從寵物診所收到的具有神經(jīng)癥狀的病犬腦組織病料，經(jīng)Vero細胞接種、電鏡觀察、動物回歸試驗、PCR特異性檢測確診病犬死于PRV感染。

本研究從疑似偽狂犬病的2份犬腦組織病料中分離鑒定了2株偽狂犬病毒，我們曾對PRV的TK、gE、gC和gD共4個基因進行了擴增。由于有關(guān) I 型皰疹病毒gE和TK基因遺傳多樣性數(shù)據(jù)匱乏，我們選擇了 I 型皰疹病毒基因組中研究最多的gC蛋白基因，gC基因已廣泛用于PRV毒株的遺傳演化和分子流行病學(xué)分析[21,22]。本研究所采病料來自吉林省長春市，該地區(qū)未曾有PRV gC基因的分析報道。本研究基于gC基因核苷酸序列繪制遺傳進化樹，分析結(jié)果顯示，JLCC-2012與JLCC-2013株同源性為100%，與國內(nèi)犬源分離株BJ/RD、BJ/YT間同源性分別為99.93%、100%，與豬源偽狂犬病毒分離株同源性為94.33%～100%，與國外豬源性狂犬病毒分離株的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列變異率較高，同源性為93.58～94.81%，可以初步推測犬偽狂犬病各毒株間變異較小，對該病的預(yù)防提供了一定理論基礎(chǔ)。

TK基因缺失株P(guān)RV弱毒對犬的安全性未見報道，潛伏感染PRV對犬的致病性也不清楚。本研究的2株分離株TK基因ORF完整，因此可排除疫苗株引起感染的可能性。2株分離株gE和gC基因均變異較小，由于PRV毒力與很多因素有關(guān)，這些變異是否與其毒力有關(guān)仍有待于進一步研究。

目前尚無犬用的偽狂犬病疫苗。由于PRV在豬體內(nèi)具有潛伏感染特性，我們通過本研究分析認為，防止犬偽狂犬病發(fā)生的措施主要是避免犬生吃豬產(chǎn)品尤其是病豬肉或骨頭，從長遠來看，尤其是對那些大型養(yǎng)犬場，如不能避免攝食生肉或骨頭，建議試用安全有效的偽狂犬病活疫苗或滅活疫苗。

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ISOLATION AND IDENTIFICATION OF PSEUDORABIES VIRUS FROM DOGS

JIN Hong-liang1,2, LIU Ye2, LI Nan2, LI Zhi-jun2,3, ZHAO Jing-hui2, WANG Shu-chao2, ZHANG Shou-feng2, HU Rong-liang2
(1.College of Animal Science and Technology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China; 2.Military Veterinary Research Institute, Science, Academy of Military Medical Sciences, Changchun 130122, China; 3.School of Public Health, Jilin University, Changchun 130021, China)

In the winter of 2012 and 2013, some canine cases were initially diagnosed as Pseudorabies virus(PRV) infection according to their clinical signs at a pet animal hospital in Changchun.The brain tissues of the diseased dogs were submitted to our laboratory for confi rmation.The examination under electron microscope, animal experiment and PCR on the brain tissues confi rmed positive results.Two virus strains were obtained and designated as JLCC-2012 and JLCC-2013.Their gC gene fragments were amplifi ed using respective primers.Sequence analysis of gC gene showed 100% homology between JLCC-2012 and JLCC-2013.Further phylogenetic analysis of nucleotide sequence of gC gene revealed that these two strains had identity at 99.93% and 100% with recently isolated canine BJ/RD and BJ/YT strains, 94.33%-100% with swine PRV strains kept in our laboratory and 93.58%-94.81% with foreign swine PRV strains published in the literature.The results confi rmed that those canine cases were infected with PRV.

Pseudorabies virus; isolation; identifi cation; infection; phylogenetic analysis; dogs

S852.659.1

：A

：1674-6422（2015）01-0009-06

2014-08-27

863計劃（2011AA10A212）

靳紅亮，男，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

扈榮良，E-mail：ronglianghu@hotmail.com