繆 佶，鮑衍清，邵紅霞，錢 琨，秦愛建

（1.教育部禽類預防醫(yī)學省部共建重點實驗室，揚州225009；2.揚州大學 江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室，揚州225009）

·研究論文·

多重實時熒光PCR檢測禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒方法的建立以及初步應用

繆 佶1,2，鮑衍清1,2，邵紅霞1,2，錢 琨1,2，秦愛建1,2

（1.教育部禽類預防醫(yī)學省部共建重點實驗室，揚州225009；2.揚州大學 江蘇省動物預防醫(yī)學重點實驗室，揚州225009）

本文建立了一種快速、靈敏、特異性強的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）檢測方法，并對REV在雞胚成纖維細胞（chick embryo fi broblast，CEF）上的增殖動態(tài)規(guī)律進行研究。分別針對gag、env以及LTR基因的保守序列設計3對引物，利用重組質(zhì)粒作為模板，繪制3種不同基因的標準曲線。檢測結(jié)果顯示，本研究建立了多重實時熒光PCR檢測方法，所制備的標準品模板在108～ 101copies范圍內(nèi)與Ct值之間呈現(xiàn)良好的線性關系，且最低檢出量為101copies。REV感染CEF后gag、env、LTR基因的拷貝數(shù)均先減少后增多。通過實時熒光PCR技術(shù)與間接免疫熒光方法檢測，發(fā)現(xiàn)REV在CEF上復制的初始階段呈現(xiàn)病毒適應過程，此后病毒大量復制，表現(xiàn)出明顯的增長趨勢。該研究不僅為REV的診斷技術(shù)提供了一種新的方法，同時也為深入研究REV的感染機制和致病機理奠定了基礎。

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒；雞胚成纖維細胞；實時熒光PCR；復制

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（Reticuloendotheliosis virus，REV）最初于1958年從火雞脾臟中分離出，屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科，能引起雞、鴨、鵝、火雞和其他禽類發(fā)生免疫抑制、腫瘤形成和矮小綜合征[1]。該病毒所引起的網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥在英國、德國、澳大利亞、匈牙利等國均有報道，中國于20世紀80年代在南京首次分離到[2]。目前已分離到的不同毒株雖致病力不同，但均屬于同一血清型，具有相似的抗原性。REV在我國家禽中的流行越來越嚴重，感染率已達20%～30%[3]。該病毒不僅能垂直傳播，亦可通過接觸水平傳播。另一方面，REV在疫苗等生物制品中的污染和傳播也是引起感染和流行的重要因素[4-6]。此外，REV與其他免疫抑制病毒在雞群中的混合感染已嚴重危害當前養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[7,8]。

目前，對于REV分子流行病學以及致病機理的研究尚有不足。隨著分子生物學技術(shù)更廣泛地應用于病毒學研究，實時熒光定量PCR技術(shù)以其快速、敏感、特異性強等優(yōu)點在病毒定性和定量檢測以及基因表達水平分析等方面取得迅猛的發(fā)展[9,10]。本研究針對REV的gag基因、env基因以及LTR基因，分別建立了SYBR Green I實時熒光PCR檢測方法，并首次應用于該病毒的體外復制動力學研究，與傳統(tǒng)方法相比更加快速、敏感，為REV的檢測以及致病機理、免疫抑制等方面研究提供了一種有效的手段。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒（REV）、禽白血病J亞群病毒（Avian leukosis virus-J subgroup, ALV-J）、雞傳染性貧血病毒（Chicken infectious anemia virus，CAV）以及雞馬立克氏病毒（Marek' s disease virus，MDV）均由本實驗室自主分離與保存；SPF雞胚由北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司提供，經(jīng)常規(guī)方法制備成雞胚成纖維細胞。

1.2 主要試劑總RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒以及小量質(zhì)粒抽提試劑盒均為Axygen公司產(chǎn)品；pGEM-T Easy載體購自Promega公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBR Green熒光定量PCR通用試劑盒等購自TaKaRa公司；基礎培養(yǎng)基：DMEM粉（Gibco公司）13.4 g、NaHCO33.7 g、超純水1000 mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.2～7.4，過濾除菌后于4℃保存；5%生長液：95 mL基礎培養(yǎng)基加5 mL胎牛血清（Gibco公司）；1%維持液：40 mL基礎培養(yǎng)基中加入10 mL 的5%生長液。

1.3 引物設計通過DNAStar軟件對GenBank中已公布的參考序列進行分析，并根據(jù)其中g(shù)ag基因、env基因以及LTR基因中的保守序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物（表1），由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 RNA的提取與cDNA合成感染病毒的細胞用RNA提取試劑盒中溶液重懸，并按照試劑盒說明提取基因組RNA，最終將提取的總RNA溶于50 μLTE緩沖液中，-70℃保存。取上述所提總RNA（1 μg）進行反轉(zhuǎn)錄，按照試劑盒中提供反應體系進行反轉(zhuǎn)錄，總體積為20 μL。

表1 熒光定量PCR引物Table1 Primers used for real-time PCR in this study

1.5 標準品的制備以上述提取并合成的cDNA為模板，利用常規(guī)RT-PCR方法擴增REV基因組中g(shù)ag基因、env基因以及LTR基因，其中完整gag基因組長度為627 bp，完整env基因組長度為1321 bp，部分LTR基因組長度為330 bp?；厥漳康钠魏笈cpGEM-T Easy載體連接、轉(zhuǎn)化，挑選陽性菌鑒定并送至上海生物工程技術(shù)有限公司測序，序列驗證為陽性的重組質(zhì)粒經(jīng)純化后用紫外分光光度計測OD260，再換算成摩爾濃度，通過以下公式計算質(zhì)粒拷貝數(shù)[11]：

以上3個重組質(zhì)粒分別稀釋為8個不同的稀釋度（108～101copies/μL）作為標準品，稀釋后的標準品-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 熒光定量PCR檢測方法的建立本研究所有熒光定量PCR均基于ABI 7500系統(tǒng)。以上述標準品為模板進行熒光定量PCR反應，總體積為20 μL，其中SYBR Green I實時熒光PCR反應液10 μL，上、下游引物（10 μmol/mL）各0.8 μL，0.4 μL Rox校正染料，質(zhì)粒模板2 μL，補水至20 μL。反應條件為95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火并延伸34 s，共擴增40個循環(huán)，延伸時收集熒光，最后在70℃～90℃過程中制作溶解曲線。陽性的判定標準為：1.35個循環(huán)以前檢測到熒光信號；2.35～40個循環(huán)內(nèi)檢測到熒光信號，重復3次，且均能檢測到熒光信號。反之，則判定為陰性。對于gag、env、LTR基因的熒光定量PCR檢測方法中，所有的反應體系和反應條件均相同，以便3個不同基因可以同時進行實驗。

1.7 熒光定量特異性、敏感性及重復性實驗將倍比稀釋為108～101copies/μL的3種基因的標準品作為模板，分別進行常規(guī)RT-PCR擴增以及SYBR Green I實時熒光PCR，以確定兩種方法所檢測的最低拷貝數(shù)，從而對常規(guī)RT-PCR和熒光定量PCR的敏感性進行比較。

以REV、ALV-J的RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，CAV、MDV的DNA以及保存的3種基因的標準品為模板，分別進行SYBR Green I實時熒光PCR，以此驗證所建立方法的特異性。

分別取gag、env以及LTR基因的標準品中106、104、102copies/μL3個稀釋度作為模板連續(xù)擴增3次，以測定批內(nèi)重復性。

1.8 熒光定量方法在REV感染復制過程中的初步應用原代CEF細胞以1×105個/孔的密度在24孔板中用5%生長液培養(yǎng)，按MOI為1的比例感染REV病毒懸液并孵育2 h，細胞洗滌3次后加入1%維持液，37℃、5% CO2。分別在1、2、3、4、5、6、7、10 d收集感染細胞并按照之前所述方法提取RNA，再進行cDNA合成。

以上述cDNA作為SYBR Green I 實時熒光PCR的模板。其中，反轉(zhuǎn)錄時RNA均定量為1 μg，熒光定量PCR時所加入模板體積也均相同，設立3個重復，最后根據(jù)標準曲線計算拷貝數(shù)。此外，選擇雞18S rRNA作為內(nèi)參基因，采用實時定量PCR和2-△△CT相對表達法進行基因的表達量分析[12]，進而比較兩種方法的檢測結(jié)果。

1.9 間接免疫熒光方法檢測REV在CEF中的復制間接免疫熒光檢測方法（indired fimmunfluorescene, IFA）參考崔治中等[13]的報道。具體方法如下：原代CEF細胞以1×105個/孔的密度在24孔板中培養(yǎng)，感染REV后，在相應時間點棄去上清，PBS洗滌1次，室溫下用預冷的丙酮∶乙醇（3∶2）固定10 min，PBS洗滌1次，自然干燥后于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將REV單抗腹水作為一抗，用PBS進行1∶500稀釋，與上述REV感染的細胞在37℃水浴作用45 min，PBS洗滌3次，再加入工作濃度的FITC標記的羊抗鼠IgG，37℃避光孵育30 min，PBS洗滌5次后用50%甘油覆蓋，在OLYMPUS IX50熒光顯微鏡下觀察，同時設置陰、陽性對照。

2 結(jié)果

2.1 標準曲線的建立為建立gag基因、env基因以及LTR基因的標準曲線，重組質(zhì)粒pGEM-gag，pGEM-env和pGEM-LTR純化后測其含量并計算拷貝數(shù)，分別取108～101copies/μL共8個不同稀釋度，以此為模板進行熒光定量PCR擴增。ABI 7500系統(tǒng)自動生成擴增動力曲線（圖1）；以Ct值為縱坐標，以模板拷貝數(shù)為橫坐標生成相應的標準曲線（圖2）。從圖中可見，gag、env、LTR gene 3個標準品所建立的熒光定量PCR方法的最低檢測限均為101copies，且都在101～108copies/μL范圍內(nèi)有很好的線性關系。其中，gag基因檢測的Ct值為7.92～29.75，相關系數(shù)R2=0.999，擴增效率為109.2%；env基因檢測的Ct值為8.55～30.66，相關系數(shù)R2=0.998，擴增效率為107.4%；LTR基因檢測的Ct值為9.73～32.11，相關系數(shù)R2=0.998，擴增效率為105.4%。此外，3個基因的熔解曲線的波峰均單一，其熔解溫度分別為83.92℃± 0.10℃（gag）、83.92℃± 0.09℃（env）、82.61℃± 0.13℃（LTR），無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物。

圖1 熒光定量PCR檢測標準品的擴增曲線Fig.1 Amplifi cation curve profi les of gag, env g and LTR gene by quantitation real-time PCR

圖2 熒光定量PCR檢測標準品的標準曲線Fig.2 Standard curve of gag, env and LTR gene by quantitation real-time PCR

2.2 敏感性比較以及特異性、重復性實驗將10倍倍比稀釋的gag基因、env基因和LTR基因的標準品作為模板，利用常規(guī)RT-PCR方法進行檢測（圖3），最小檢出量均為104copies。而熒光定量PCR方法的最小檢出量為101copies，敏感性比常規(guī)的RT-PCR方法高1000倍。

圖3 常規(guī)RT-PCR方法對不同稀釋濃度的標準品的檢測結(jié)果Fig.3 RT-PCR amplifi cation result of serial dilutions of standard plasmids

以REV、ALV-J的RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA，CAV、MDV的DNA以及保存的3種基因的標準品為模板，分別進行SYBR Green I 實時熒光PCR試驗，并設立陰性對照。結(jié)果表明，3種基因的熒光定量PCR方法在分別檢測的過程中，僅REV反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA以及相應的陽性標準品出現(xiàn)擴增曲線，其他病毒樣品以及陰性對照的檢測結(jié)果均為陰性（圖4）。

圖4 熒光定量PCR檢測REV的特異性試驗Fig.4 Specifi city of fl uorescent quantitative PCR for detection of Reticuloendotheliosis virus

分別取gag、env、LTR基因的標準品中106、104、102copies/μL三個稀釋度作為模板連續(xù)擴增3次，且重復擴增3次的變異系數(shù)均小于0.005（圖5）。結(jié)果表明，本研究所建立的REV 3種基因的熒光定量PCR方法具有較高的可重復性。

圖5 熒光定量PCR重復性試驗擴增動力曲線Fig.5 The amplifi cation dynamic curve of repetitive test for fl uorescent quantitative PCR

2.3 檢測REV在CEF中的復制過程

2.3.1 絕對定量實時熒光PCR方法 對感染后不同時間點的CEF細胞進行總RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為模板分別進行g(shù)ag基因、env基因以及LTR基因的熒光定量PCR試驗，并得到相應的Ct值。通過此前所建立的gag基因的回歸方程：y= 32.87- 3.119x、env基因的回歸方程：y= 33.818- 3.158x、LTR基因的回歸方程：y= 35.311-3.198x，計算得到REV感染CEF過程中3個基因各自在不同時間點的拷貝數(shù)（圖6）。由圖中可見，REV 的gag、env及LTR 三個基因的拷貝數(shù)均呈現(xiàn)先減少后增多的趨勢，且在d3時的拷貝數(shù)為最低值，隨后拷貝數(shù)逐漸增多。

圖6 絕對定量實時熒光PCR方法檢測REV在細胞中的復制Fig.6 Detection of replication kinetics for REV in CEFs using quantitative SYBR green I real-time PCR

2.3.2 相對定量實時熒光PCR方法 采用實時定量PCR和2-△△CT相對表達法進行基因的表達量分析，選擇雞18S rRNA作為內(nèi)參基因，分別得到gag基因、env基因和LTR 3個基因的相對表達變化倍數(shù)（圖7）。3個基因的表達量均在早期下降，d3的表達量最低，隨后呈現(xiàn)表達量逐漸升高的整體趨勢。與絕對定量方法相比，兩種方法的結(jié)果所反映出病毒在細胞中的復制過程基本一致。

2.3.3 間接免疫熒光方法 由于CEF感染REV時無明顯細胞病變，因而利用間接免疫熒光方法對REV核心蛋白進行檢測。病毒感染原代CEF細胞，感染量MOI為1，37℃作用2 h后移去病毒，清洗后添加維持液進行培養(yǎng)，分別在d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7、d10進行IFA（圖8）。結(jié)果顯示，病毒感染細胞后，最早在d4出現(xiàn)陽性反應，且在d7時陽性反應最強。

圖7 實時熒光PCR相對表達法檢測REV感染后基因表達變化Fig.7 The variation curve of REV replication by using quantitative real-time PCR and the 2-△△CTmethod

圖8 感染后不同時間點的間接免疫熒光結(jié)果Fig.8 Analysis of REV infection at different time points by indirect immunofl uorescence(IFA)

3 討論

禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥是禽類重要的免疫抑制性和病毒致瘤性疾病之一，不僅能夠引發(fā)腫瘤形成，還能造成感染禽類的胸腺、法氏囊等免疫組織器官萎縮，使其免疫功能下降甚至喪失，從而導致免疫抑制，致使感染禽類極易繼發(fā)感染其他病原微生物[14]。REV屬于反轉(zhuǎn)錄病毒科禽類C型反轉(zhuǎn)錄病毒，基因組為單股RNA，含有g(shù)ag、pol、env等結(jié)構(gòu)基因以及長末端重復序列（LTR）。群抗原（gag）基因編碼p30、p10、pp18、pp20、p12等結(jié)構(gòu)蛋白，其中p30是群主要特異性抗原，在病毒粒子裝配過程中發(fā)揮作用[15]。囊膜蛋白（env）基因編碼gp20 和gp90兩種糖蛋白，其中g(shù)p90是病毒的免疫原性蛋白，具有順式構(gòu)象表位[16]。由于REV各基因在病毒復制過程中的不同特性與功能，本研究設計了分別針對gag基因、env基因、LTR基因的引物來進行特異性的檢測。

目前，國內(nèi)外已有將實時熒光PCR技術(shù)應用于REV定性和定量的報道。宋麗等[17]針對REV的LTR序列設計引物并建立了SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR方法檢測臨床疑似病例。Sun等[18]通過建立雙重實時PCR方法分別檢測血樣中的env基因以及LTR基因，在提取基因組DNA時采用苯酚-氯仿抽提以及微球順磁珠試劑盒兩種不同方式。Li等[19]針對env基因保守區(qū)建立了Taqman熒光定量RT-PCR檢測方法，但這種方法需要合成昂貴的探針，從而增加了成本。目前所報道的實時熒光PCR檢測REV方法中尚無關于REV在細胞中復制的研究，對于REV體外復制研究還是主要通過傳統(tǒng)的TCID50法[20]。已有研究表明熒光定量PCR方法更適合用于禽類病毒在細胞上復制的動力學研究，相比傳統(tǒng)的TCID50法更加快速、敏感[21,22]。本研究首次應用所建立的多重實時熒光RT-PCR方法對REV在CEF上增殖動態(tài)進行了初步研究。針對REV的gag基因、env基因以及LTR基因保守區(qū)設計特異性的引物所建立的SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR方法，重復性好且特異性強，比常規(guī)RT-PCR方法的敏感性高出1000倍，最小檢出量為101copies。同時檢測REV中的3個基因，可以更準確且全面的衡量評價病毒在細胞上的復制過程，從而避免只檢測病毒單一基因所帶來的缺陷。

從絕對定量實時熒光PCR方法檢測結(jié)果中可以看出，gag基因、env基因以及LTR基因的拷貝數(shù)從d1至d3均逐漸減少，并在d3達到最低值，隨后從d4開始逐漸增多。另外，通過引入雞18S rRNA作為內(nèi)參基因，采用實時定量PCR和2-△△CT相對表達法進行基因的表達量分析對比，3個基因的表達倍數(shù)變化的總體趨勢均呈現(xiàn)先下降后上升的過程。由此表明，兩種實時熒光方法所反映的結(jié)果基本一致，病毒在復制過程中先經(jīng)過適應期，病毒量逐漸減少，隨后病毒開始大量復制，并隨著時間的延長而病毒量增加。此外，在同一時間點所檢測到的不同基因的拷貝數(shù)并不相等，gag基因的拷貝數(shù)要小于env基因以及LTR基因。出現(xiàn)這一現(xiàn)象，可能是由于病毒復制過程中不同基因及其蛋白所表現(xiàn)的不同功能特性，并發(fā)揮不同作用影響的原因[23,24]?？梢娮鳛闄z測REV的方法而言，針對env或者LTR基因建立SYBR Green Ⅰ實時熒光PCR方法應該是較好的選擇。

REV在培養(yǎng)過程中可長期與CEF細胞共存，不斷地進行復制，但由于無明顯細胞病變（cytopathic effect, CPE）而不易觀察[25]。利用針對REV核心蛋白的抗體，IFA檢測結(jié)果表明病毒在d4時出現(xiàn)熒光，d7熒光強度最強，d10仍可見大量熒光但細胞狀態(tài)不佳。通過比較，可以看出IFA檢測REV復制過程時，并不能反映出利用實時熒光PCR方法所表現(xiàn)出病毒先減少后增多的趨勢。這兩種方法分別從蛋白水平以及基因水平豐富了REV的病毒檢測方法和體外復制研究手段。

本研究所建立的方法，實現(xiàn)了對REV在細胞上快速、靈敏、特異的實時監(jiān)控，為REV的快速診斷、流行病學調(diào)查以及禽源疫苗污染的檢測提供了新的思路與方法，同時也為REV的感染機制、免疫抑制致病機理和預防措施等方面的研究奠定了基礎。

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DEVELOPMENT AND PRELIMINARY APPLICATION OF A SYBR GREEN I BASED MULTIPLE REAL-TIME PCR ASSAY FOR DETECTION OF RETICULOENDOTHELIOSIS VIRUS IN CHICKEN EMBRYO FIBROBLASTS

MIAO Ji1,2, BAO Yan-qing1,2, SHAO Hong-xia1,2, QIAN Kun1,2, QIN Ai-jian1,2
(1.Ministry of Education Key Laboratory for Avian Preventive Medicine, Yangzhou 225009, China; 2.Key Laboratory of Jiangsu Preventive Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

The objective of the present study was to develop a rapid, sensitive and specifi c method for detection of Reticuloendotheliosis virus (REV) in host cells and evaluation of replication kinetics for REV in chicken embryo fibroblasts (CEFs).Real-time PCR was developed using SYBR Green I and three pairs of primers specific to the conserved regions of gag, env and LTR genes and used to measure copies of viral genes at different days post infection.The results showed real-time PCR assay detected REV in the range of 108to 101copies with the detection limit at 101copies.The copy numbers of these viral genes were detected in low level at initial infection stage followed by abundant increase.As compared with indirect immunofl uorescence assay (IFA), real-time PCR demonstrated the presence of REV in CEFs at early infection immediately following by massive virus replication.In conclusion, development of real-time PCR provided a new method for REV detection and further research on mechanisms of infection and pathogenesis.

Reticuloendotheliosis virus (REV); chicken embryo fi broblasts (CEF); real-time PCR; replication

S852.659.3

：A

：1674-6422（2015）01-0001-08

2014-08-29

江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目；國家科技基礎性工作專項（2013FY113300-4）

繆佶，男，博士研究生，預防獸醫(yī)學專業(yè)

秦愛建，E-mail：aijian@yzu.edu.cn